PECES DE ADN 3D: una técnica para localizar un gen específico en un cromosoma

En este artículo

Resumen

Fuente: Gallerani, G. et.al. Caracterización de células tumorales utilizando un cable médico para capturar células tumorales circulantes: un enfoque 3D basado en inmunofluorescencia y ADN FISH. J. Vis. Exp. (2017).

El aislamiento y caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) de la sangre de pacientes con cáncer es un tipo de biopsia líquida no invasiva y se asocia con recaída y progresión de la enfermedad. Este video describe la técnica de hibridación fluorescente in situ de ADN (DNA FISH) en CTC capturadas en un cable médico, para estudiar un gen específico de interés.

Protocolo

1. 3D DNA-FISH Día 2

>PRECAUCIÓN: Se debe prestar especial atención a la alta temperatura de los instrumentos y a la cámara húmeda.

Configure el horno de hibridación y el horno de calor seco (~ 3 h antes de iniciar el protocolo DNA-FISH). Ajuste el horno de hibridación a 75 °C, ajuste el horno de calor seco a 37 °C y enfríe la solución de SSC 0,4× (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 °C.
nota: El estado del pH de los tampones FISH es crítico y debe ser de 7,0 ± 0,1.
Lave el alambre 3 veces en una solución SSC de 0,4× helada.
nota: Mantenga el alambre en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo con fluorocromo durante los siguientes procedimientos.
Secar durante 10 minutos en la oscuridad debajo de la vitrina de gases.
Vórtice y gire la sonda durante 5 s.
Deje caer 10 μL de la sonda en los microtubos de vidrio. Cubra con film de laboratorio.
Gire los microtubos de la siguiente manera: envuelva el microtubo en un absorbente seco, coloque papel en un tubo de 50 ml y gire brevemente.
Coloque con cuidado el alambre seco en el microtubo e inserte el tapón de alambre. Sellar con cemento de caucho.
cautela: Los siguientes dos pasos implican altas temperaturas. Use guantes protectores.
Coloque el alambre en una cámara oscura y húmeda en el horno de hibridación durante 8 min a 75 °C para obtener la desnaturalización completa del ADN.
Traslade la cámara húmeda a un horno de calor seco a 37 °C durante la noche.

2. 3D DNA-FISH Día 3

Coloque un frasco de tinción deslizante con una solución de SSC al 0,4× en un baño de agua y colóquelo a 72 °C.
Compruebe la temperatura de la solución de SSC de 0,4× hasta que alcance los 72 ± 1 °C.
Prepare dos vasos de precipitados de vidrio, uno con 2× SSC + 0,05% de solución Tween (pH = 7,0 ± 0,1) y el segundo con agua destilada.
Retire la cámara húmeda del horno de calor seco, retire con cuidado el cemento de goma del tapón de alambre con pinzas y saque el alambre.
nota: Tire con cuidado del extremo no recubierto del cable a través del IN-Stopper, teniendo cuidado de no dañar la punta funcionalizada.
Sumerja el cable en la solución de SSC al 0,4× durante 2 minutos a 72 °C.
Lave el alambre en una solución de 2× SSC + 0,05% Tween durante 30 s a RT.
Lave el cable en agua destilada a RT.
Seque el cable debajo de la campana extractora durante 10 minutos en la oscuridad.
Prepare una solución madre DAPI de 1,43 μM en 2 mL de 1× PBS.
Incubar la punta funcionalizada del alambre con solución de DAPI en un vial de 2 mL durante 1 h en la oscuridad a RT.
Enjuague el alambre dos veces en 1× PBS y seque al aire.

3. 3D Observación y análisis microscópico

Coloque el cable en el soporte de cable. Inserte con cuidado la punta funcionalizada a través del punto de entrada del soporte especial, hasta que la punta coincida con el punto de acoplamiento. Tenga cuidado de no dañar la punta funcionalizada (Figura 1a).
Coloque el soporte especial en la platina del microscopio. Ajuste el enfoque del microscopio con una lente de 20×. Primero concéntrese en el soporte especial y luego ajuste finamente en las celdas que parecen brillantes en el canal DAPI.

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Resultados

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Figura 1: Alambre funcionalizado, disposición esquemática de las sondas de ruptura de ALK, esquema de patrones esperados de reorganización de ALK y soporte especial.(a) Las cajas rojas resaltan las tres partes principales del alambre: punta funcionalizada, tope de cable y punta no funcionalizada. La punta funcionalizada es la parte más delicada del alambre y no debe ...