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1. Fijación y procesamiento de los cortes de tejido
- Levante con cuidado la referencia 0 h sin cultivar o la rebanada cultivada sobre un papel de filtro empapado en PBS.
- Para hacer esto, agregue 2-3 mL de PBS encima de un papel de filtro colocado en un plato de 10 cm. Coloca la rebanada encima del papel de filtro y levanta el papel de filtro con un par de pinzas.
- Transfiera el papel de filtro a un histocassette y agregue una gota de hematoxilina diluida (1:1 en agua desionizada) encima del corte de tejido para marcar visiblemente la posición del corte durante los pasos de procesamiento posteriores (Figura 1D).
- Cierre el casete y transfiéralo a una solución de formalina tamponada neutra al 4%. Fije los pañuelos durante la noche a 4 °C.
nota: Mientras coloca la rebanada encima del papel de filtro, asegúrese de que la sección superior de la rebanada esté hacia arriba; Esto es necesario para seguir la sección superior, media e inferior de un corte durante el seccionamiento y el análisis, como se describe en el paso 2.3.
- Al día siguiente, transfiera los casetes a EtOH al 70% e inmediatamente continúe con el paso de procesamiento del tejido incluido en parafina.
- Antes del procesamiento de tejidos, lave las histocasettas en EtOH 100% 2x durante 10 minutos cada una. En este caso, utilice una estación de microondas para el procesamiento de tejidos. Seleccione el programa utilizado para un espesor de tejido de 1 mm y siga las instrucciones proporcionadas en el manual (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
nota: Cuando utilice otras máquinas de procesamiento de tejidos, utilice el programa adecuado para muestras de tejido fino.
- Para la inclusión en parafina, abra un histocassette y use un bisturí para levantar con cuidado la rebanada del papel de filtro. Deseche el papel de filtro y transfiera la rebanada a un molde que contenga parafina líquida.
- Presione el tejido contra el fondo del molde de inclusión, por ejemplo, con un peso plano, para asegurar un corte uniforme. Coloque la parte inferior del histocasette encima del molde, agregue parafina líquida encima. Deje enfriar el molde sobre un paté frío durante 30 minutos y separe el molde del bloque de parafina.
nota: Como alternativa a la incrustación horizontal, es posible incrustar el corte del tumor verticalmente colocando el corte en posición vertical. Las secciones verticales permiten fácilmente el análisis de gradientes en viabilidad o expresión de marcadores funcionales en una sola sección. El análisis de gradiente con cortes incrustados horizontalmente requiere el seccionamiento en parafina como se describe en el paso 2.2.
2. Procesamiento y análisis de tejidos fijados en formol e integrados en parafina (FFPE)
- Prepare secciones delgadas de 4 μm de los bloques de corte de tejido FFPE con un micrótomo. Al seccionar, ajuste el ángulo del bloque para que la superficie del bloque esté orientada horizontalmente con respecto a la hoja; Esto es necesario para obtener secciones uniformes en todo el tejido.
- Para permitir la captura de un posible gradiente de viabilidad inducido por el cultivo, la migración celular a través de los cortes o los gradientes en la expresión de biomarcadores a través de los cortes cultivados, recoja secciones de las capas superior, central e inferior de cada uno de los cortes de tejido en portaobjetos como se explica a continuación.
- Recoja primero secciones secuenciales de tejido de la rebanada de tejido incrustado en parafina en la parte superior de los portaobjetos de vidrio. Continúe recolectando las secciones de las capas de tejido más profundas hasta el medio, seguidas de la parte inferior de los portaobjetos de vidrio (Figura 1E).
nota: Para acomodar tres secciones en un portaobjetos de vidrio, recorte el exceso de parafina que rodea la rebanada de tejido incrustada.
- Deje que las secciones se sequen durante la noche a 37 °C y proceda con la tinción de H&E o inmunohistoquímica como se describe a continuación.
nota: La pérdida de antigenicidad puede ocurrir cuando las secciones de FFPE se almacenan a altas temperaturas o durante períodos prolongados de tiempo. Se recomienda almacenar las secciones de parafina a 4 °C, y los análisis de IHQ deben realizarse dentro de los 6 meses posteriores al corte.
- Para la tinción de H&E, desparafinar y rehidratar las secciones de parafina de la siguiente manera: xileno 3 veces durante 5 minutos, 100 % EtOH 3 veces durante 1 minuto, 96 % EtOH 2 veces durante 1 minuto, 70 % EtOH 1 x 1 minuto y agua desionizada 2 veces durante 1 minuto.
- Incubar las secciones en una solución de hematoxilina recién filtrada durante 10 minutos y lavarlas con agua corriente del grifo durante 5 minutos. Sumerjar las secciones en alcohol ácido (1% de HCl en 70% de EtOH) durante 2 veces y lavarlas con agua corriente del grifo durante 5 minutos, seguidas de una incubación con eosina al 0,5% durante 2 minutos.
- Después de la etapa de eosina, deshidrate las secciones sumergiendo los portaobjetos en soluciones de alcohol y xileno, de la siguiente manera: 96% EtOH 2x durante 15 s, 100% EtOH 3x durante 30 s, xileno 3x durante 1 min. Por último, incruste las secciones en un medio de montaje a base de xileno.
