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1. Preparación de las células y el medio
- Prepare el medio utilizando 240 ml de Iscove's Modified Dubecco's Medium (IMDM) y 50 ml de suero fetal bovino. No descongele el suero fetal bovino en un baño de agua caliente, ya que los aumentos rápidos de temperatura pueden comprometer la estabilidad del suero. Combine 240 μl de gentamicina 50 mg/ml y 5 ml de penicilina/estreptomicina 100x en un matraz de cultivo estándar y agregue al medio. Almacene el medio a 4 °C.
- Siembre las células U937 a ~4 x 104 células/ml en un matraz de 25cm2 utilizando el medio preparado. Evalúe la concentración y viabilidad de las células utilizando un contador de células TC20 y la exclusión de azul de tripano colocando 15-20 μl de células y 15-20 μl de azul de tripán en un tubo de microcentrífuga y mezclando el contenido. Pipetee 15-20 μl de esta mezcla en un portaobjetos de muestreo TC20 e inicie los recuentos colocando el portaobjetos en el contador de células TC20.
- Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2, y comprobar la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripano y el contador de células TC20. Cuando las células se encuentren en una concentración adecuada y/o hayan sido tratadas con sonosensibilizantes durante un período de tiempo adecuado, transfiera 3 ml de células del matraz de cultivo a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. En este protocolo, se cultivan células U937 durante 48 horas y luego se tratan con 0,5, 1 o 5 mM de MeβCD durante 30 minutos para agotar suficientemente el colesterol de las células antes de la sonicación.
>2. Sonicación celular
- Desgasificar el agua destilada y desionizada utilizando un vacío y un matraz Buchner. Transfiera el agua al cuerno de la taza y llénelo hasta un nivel de 15 mm por encima de la parte superior del cuerno. El proceso de sonicación provoca una mayor desgasificación del agua durante un periodo de unos minutos, y puede dar lugar a incoherencias a lo largo del experimento si el sistema no se ejecuta antes de la sonicación de la muestra. Por lo tanto, haga funcionar el sistema durante ~7 minutos antes de la sonicación de la muestra.
- Conecte el vial de centelleo que contiene las células al dispositivo de retención. A continuación, fije el dispositivo de sujeción a la parte superior de la bocina de la copa y ajústelo a una elevación de 15 mm desde la parte superior de la bocina (en la superficie del agua mediante el mecanismo de deslizamiento).
- Por lo general, las células se sonican utilizando tres pulsos de ultrasonido de 1 segundo, con un espacio de 1 segundo entre cada uno de estos pulsos. Para este protocolo, sonicate células a 33% y 50% de amplitud utilizando la dosificación de pulsos mencionada anteriormente.
>3. Evaluación de las células para el daño posterior a la sonicación
- Evalúe el daño y la viabilidad de las células suspendidas utilizando azul de tripán y el contador de células TC20. Además, analice la muestra utilizando un contador Z2. Para el análisis del contador Z2, pipetear una suspensión celular de 100 μl en solución salina isotónica de 20 ml (proporción 200:1). Antes del análisis, enjuague la apertura del analizador de partículas Z2 al menos dos veces con solución salina isotónica. Coloque la muestra Z2 en el soporte del mostrador y eleve la plataforma hasta la abertura antes de iniciar los recuentos.
- Adquiera los datos de los contadores TC20 y Z2 utilizando el software proporcionado por el fabricante. Analice estos datos para detectar el daño celular, la viabilidad y la creación de residuos celulares a partir de la sonicación.