Ensayo XTT: un ensayo colorimétrico para evaluar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial

Resumen

Trendowski, M., et al. Generación y análisis cuantitativo de ultrasonidos pulsados de baja frecuencia para determinar la sensibilidad sonora de células neoplásicas tratadas y no tratadas. J. Vis. Exp. (2015)

Este artículo describe el protocolo para el ensayo XTT, que es un ensayo colorimétrico para evaluar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial.

Protocolo

1. Ensayo XTT para determinar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial de las células U937 y THP1 tratadas

1. Antes de los ensayos XTT, cultive células U937 y THP1 en las mismas condiciones. Trate previamente las células con el mismo rango de concentración de MeβCD durante 30 minutos antes de la sonicación. Utilice los mismos parámetros de ultrasonido que antes><, excepto que las células ahora se sonican utilizando un rango de 1-3 pulsos de un segundo espaciados por un segundo para desarrollar un rango de daño para que el kit XTT lo evalúe. nota: Muchos de estos pasos se toman directamente del manual del kit XTT y solo se repiten para comodidad de los laboratorios interesados.
2. Recoja las células por centrifugación a 200 x g durante 10 min. Resuspenda el pellet de células en el medio de crecimiento descrito anteriormente. Vuelva a suspender las células a ~1 x 10⁵ células/ml. Siembre las células U937 a 100 μl por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano por triplicado, y luego repita para las células THP1 utilizando una placa separada de 96 pocillos. Incluya 3 pocillos de control que contengan 100 μl de medio de crecimiento completo solo como lecturas de absorbancia en blanco. A continuación, incubar las placas inoculadas durante 24 horas.
3. Descongele dos alícuotas del reactivo XTT y del reactivo de activación a 37 °C antes de su uso. Gire las alícuotas suavemente hasta obtener soluciones claras. Añada 0,1 ml del reactivo de activación a 5,0 ml del reactivo XTT, lo que forma suficiente solución de XTT activada para un ensayo de placa de microtitulación de 96 pocillos. Repite el proceso para el otro plato.
4. Agregue 50 μl de la solución XTT activada a cada pocillo. Regrese la placa a la incubadora de cultivo celular de CO₂ durante 2 horas. Agite la placa suavemente después del período de incubación para distribuir uniformemente el color naranja en los pocillos positivos. Mida la absorbancia de los pocillos de ensayo que contienen las celdas y los pocillos de control de fondo en blanco a una longitud de onda entre 450 y 500 nm utilizando un lector de placas de microtitulación.
5. Ponga a cero el lector de placas de microtitulación utilizando los pocillos de control en blanco o reste su valor promedio de los resultados específicos. Mida de nuevo la absorbancia de todos los pocillos de ensayo a una longitud de onda entre 630-690 nm y reste los valores de los 450-500 nm obtenidos. Nota: Esta segunda determinación de la absorbancia ayuda a eliminar las lecturas no específicas de los resultados del ensayo. El ensayo XTT se repitió cuatro veces para ambas líneas celulares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Iscove's Modified Dulbecco's Medium con NaHCO3 y Hepes de 25 mM	Tecnologías de la Vida	12440079
Disruptor de celda Branson SLPe 40kHz con Cuphorn de 3" (25 mm)	Branson Ultrasonidos	Teléfono 101-063-726	sonicación dispositivo
Punta Una punta de filtro de 100 μl y 1.000 μl	Científico de EE. UU	1120-1840, 1126-7810
Micropipeta de 100 μl	Wheaton	851164
Micropipeta de 1000 μl	Wheaton	851168
Forma Scientific Agua de doble cámara Incubadora encamisada	Forma Científica	3131
Kit de ensayo de proliferación celular XTT	ATCC	30-1011K
Lector de microplacas de 96 pocillos	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 Células de leucemia monocítica humana	ATCC	CRL1593.2
Células de leucemia monocítica humana THP1	ATCC	TIB-202

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