Ensayo de marcaje de pulsos de bromodeoxiuridina: una técnica para medir la proliferación celular

Resumen

Fuente: Welschinger R. et al. Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo sin necesidad de sincronización. J. Vis. Exp. (2015)

El video describe el ensayo de marcaje de pulso escalonado de células de mamíferos con bromodeoxiuridina (BrdU) para medir la proliferación celular. La absorción de BrdU permite el seguimiento temporal de las células que estaban en la fase de síntesis en un momento específico, sin necesidad de que las células estén sincronizadas.

Protocolo

1. Soluciones y reactivos

1. RPMI completo
   1. Añadir 56 ml de suero fetal para terneros (FCS) y 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a un frasco de 500 ml de RPMI-1640 medium.
2. Solución de stock BrdU
   1. Prepare 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
3. BrdU RPMI completo
   1. Añadir 6,2 μl de solución madre de BrdU a 10 ml de Complete RPMI.
4. Solución DNase
   1. Prepare 1 mg de DNasa/ml en DPBS.
5. Tampón de tinción
   1. Prepare FCS al 3% inactivado por calor y azida de sodio al 0,09% en DPBS.
6. Consulte la Lista de materiales para conocer las definiciones de tampón de fijación, tampón de permeabilización y tampón de lavado.

2. Células

NOTA: Las células no se cultivaron durante más de 6 meses. Este método es directamente adaptable a cualquier línea celular no adherente con ajustes a la densidad celular y al medio de cultivo. Utilice células que estén creciendo exponencialmente al inicio del experimento.

1. Mantenga las células NALM6 en matraces de cultivo T-75 en RPMI completo. Realice todos los pasos en condiciones estériles utilizando una cabina de bioseguridad de clase II.
2. Mantenga las células NALM6 entre 1-2 x 10⁶ células por ml dividiendo el cultivo tres veces por semana.
3. Incubar a 37 °C en 5% de CO₂ en el aire.

3. Etiquetado de pulsos de células con BrdU

>PRECAUCIÓN: Manipule BrdU con cuidado, ya que es un mutágeno y teratógeno potencial.

1. Celdas de centrífuga a 150 x g durante 5 min.
   nota: La transferencia de células a medios frescos mejora la reproducibilidad de los resultados.
2. Realice un recuento de células y vuelva a suspender las células en RPMI completo a 2 x 10⁶ células/ml.
3. Diluir las células 1 en 2 con BrdU Complete RPMI produciendo una concentración final de células de 1 x 10⁶ células/ml.
4. Incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 45 min, luego diluir las células 1 en 10 con RPMI completo. Centrifugar las celdas a 150 x g durante 5 minutos y desechar cuidadosamente todo el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender las células en un volumen pequeño (~100 μl) de RPMI completo, realice un recuento de células y ajuste a 1 x 10⁶ células/ml.
6. Pipetear 1 ml de células en los pocillos de una placa de 48 pocillos. Pipetear 1 ml de DPBS en cualquier pocillo desocupado para obtener resultados más reproducibles.
7. Incubar a 37 °C en 5% de CO₂ en el aire durante los puntos de tiempo deseados, aquí 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24 hr.
   nota: El tiempo dependerá de lo que se pretenda medir en el diseño experimental.
8. Transfiera todas las células a tubos FACS con una pipeta. Enjuague el pocillo secuencialmente con volúmenes de 1 ml de PBS hasta un volumen total final de 5 ml.
9. Centrifugar a 150 x g durante 5 min y retirar con cuidado todo el sobrenadante. Las células están listas para la tinción, realice esto (sección 4) inmediatamente.

4. Tinción celular

NOTA: Si se requiere la tinción de la superficie de las células, hágala antes de la fijación, asegurándose de que las células se mantengan a 4 °C en todo momento.

1. Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de tinción (para la tinción de superficie opcional, añada el volumen recomendado de anticuerpo a los antígenos de superficie e incube durante 30 min a 4 °C).
2. Añadir 1 ml de tampón de tinción, centrifugar durante 5 min a 150 x g y desechar el sobrenadante.
   Nota: El anticuerpo específico, la concentración, el tiempo de incubación, etc., variarán en función de los objetivos experimentales específicos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NALM6	DSMZ	ACC-128
5-Bromo-2′-desoxiuridina	sigma	B5002-1G
RPMI 1.640 sin L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Suero Fetal Bovino	FisherBiotec	FBS-7100113
Incubadora de CO2	carpeta	C 150
BD Falcon 12 x 75 mm Tubos FACS	BD Biociencias	352008
Citómetro de flujo BD LSR FORTESSA	BD Biociencias	FORTESSA
centrífuga	Spintron	GT-175R