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1. Soluciones y reactivos
- RPMI completo
- Añadir 56 ml de suero fetal para terneros (FCS) y 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a un frasco de 500 ml de RPMI-1640 medium.
- Solución DNase
- Prepare 1 mg de DNasa/ml en DPBS.
- Tampón de tinción
- Prepare FCS al 3% inactivado por calor y azida de sodio al 0,09% en DPBS.
- Consulte la Lista de materiales para conocer las definiciones de tampón de fijación, tampón de permeabilización y tampón de lavado.
2. Tinción celular
NOTA: Si se requiere la tinción de la superficie de las células, hágala antes de la fijación, asegurándose de que las células se mantengan a 4 °C en todo momento.
- Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de tinción (para la tinción de superficie opcional, añada el volumen recomendado de anticuerpo a los antígenos de superficie e incube durante 30 min a 4 °C).
- Añadir 1 ml de tampón de tinción, centrifugar durante 5 min a 150 x g y desechar el sobrenadante.
nota: El anticuerpo específico, la concentración, el tiempo de incubación, etc., variarán en función de los objetivos experimentales específicos.
- Fijación y permeabilización
- Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de fijación e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar durante 5 min a 150 x g y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de permeabilización e incube las células durante 10 minutos en hielo.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar durante 5 min a 150 x g y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de fijación por tubo e incube durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar durante 5 min a 150 x g y desechar el sobrenadante.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí si es necesario. Las células fijadas son estables durante varios días a 4 °C si se resuspenden en tampón de tinción. Retire el tampón de tinción después de la centrifugación antes de continuar.
- Tratamiento con DNasa
- Vuelva a suspender las células en 100 μl de solución de DNasa (30 μg de DNasa/106 células) e incube las células durante 1 hora a 37 °C.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar a 150 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Tinción de anticuerpos
NOTA: La tinción para marcadores intracelulares distintos de BrdU se puede realizar simultáneamente con la tinción con BrdU.
- IMPORTANTE: Prepare controles de compensación que consistan en células no teñidas y células marcadas con cada fluorocromo. Lo ideal es utilizar los mismos anticuerpos para los controles de compensación que los utilizados en los tubos experimentales. Sin embargo, si esto no es posible, sustituya los anticuerpos por antígenos altamente expresados conjugados con el mismo fluorocromo.
- Vuelva a suspender las células en 50 μl de tampón de lavado y añada 1 μl/106 células de anticuerpo BrdU.
NOTA: También se pueden añadir anticuerpos directamente conjugados contra otros antígenos intracelulares específicos.
nota: Los anticuerpos contra la histona H3 fosforilada en Ser10 se pueden usar para discriminar entre células en G2 y M, la histona H3 se fosforila en Ser10 durante la mitosis. Los anticuerpos contra cdc2 fosforilados en Tyr15 se pueden utilizar para detectar células que se han comprometido con la mitosis.
- Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar las células a 150 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Manchar ADN para el análisis del ciclo celular
- Afloje el pellet y agregue 20 μl de la solución de 7-AAD (0,25 μg).
NOTA: Es fundamental utilizar una cantidad constante de 7-AAD/celda.
- Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de tinción.