Cocultivo 2D de células leucémicas con BMSC: un método para obtener subpoblaciones de células leucémicas

Resumen

Fuente: Slone, W. L. et al. Modelando la leucemia resistente a la quimioterapia in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe la técnica para el cocultivo 2D a largo plazo de células de leucemia con células estromales de médula ósea para estudiar su interacción con el microambiente de la médula ósea. El modelo de cocultivo 2D utiliza las células de leucemia linfoblástica aguda y el estroma de la médula ósea u osteoblastos que influyen en el fenotipo de las células tumorales. Este estudio apoyará la investigación de los mecanismos que subyacen a la supervivencia de las células leucémicas apoyadas en la médula ósea durante la exposición a la quimioterapia.

Protocolo

1. Preparación avanzada

1. Cultivo de células estromales de médula ósea (BMSC) y osteoblastos (OB).
   1. Mantener BMSC u OB a 37 °C con 6% de CO₂ y cultivar en placas de cultivo de tejidos de 10 cm hasta alcanzar una confluencia del 90%.
   2. Tripsinizar las células BMSC u OB y dividirlas 1:2 en nuevas placas de 10 cm. Las células se cultivan según estos estándares hasta que se necesitan para el cocultivo leucémico.

2. Establecer y mantener la cocultura

1. Agregue 5-20 x 10⁶ células leucémicas en 10 ml de medio de cultivo específico para tumores en una placa BMSC u OB confluente al 80%-90%.
   NOTA: Nuestro laboratorio mantiene cocultivos a 37 °C en 5% de_O2 para recapitular mejor el microambiente de la médula ósea, que se ha demostrado que oscila entre el 1% y el 7%. Sin embargo, el mantenimiento de cocultivos a esta tensión de oxígeno no es crítico para el establecimiento de las tres subpoblaciones leucémicas y queda a discreción del laboratorio.
2. Cada 4^días, retire todos los medios excepto 1 ml (incluidas las células leucémicas en suspensión) y reemplácelos con 9 ml de medios de cultivo leucémicos frescos. Al retirar 9 ml de medio de la placa, tenga cuidado de no alterar las células estromales de la médula ósea (BMSC) o la capa adherente de osteoblastos (OB).
   1. Retire el medio inclinando la placa hacia un lado y aspire el medio en la esquina de la placa. Además, cuando agregue medios nuevos, asegúrese de agregar gota a gota en la esquina de la placa contra la pared lateral para garantizar una interrupción mínima de la capa adherente BMSC u OB.
3. Después del^12º día de cocultivo, enjuague las células leucémicas de la capa BMSC u OB pipeteando suavemente los medios de cultivo de la placa hacia arriba y hacia abajo sobre la placa aproximadamente de 5 a 10 veces y luego recoja en un tubo cónico de 15 ml. Vuelva a sembrar en una nueva placa BMSC u OB confluente al 80%-90% como se describe en el paso 2.1.
   NOTA: El enjuague suave del cocultivo como se describe en el paso 2.3 eliminará las células leucémicas brillantes en suspensión y en fase sin interrumpir la monocapa de BMSC u OB. Esto permite que solo las células tumorales se transfieran a la siguiente placa de cocultivo. Este ciclo de 12 días se puede repetir tantas veces como sea necesario según las necesidades del usuario.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo celular de 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	664160
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	Productos médicos en todo el mundo	41021037	Se utiliza para la recolección de células
Medios de Cultura
Medios de cultivo de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para medios osteoblásticos humanos
Medios RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Para la preparación de medios tumorales
Células adherentes
Osteoblastos humanos	PromoCell	C-12720	Los osteoblastos humanos se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Células estromales de Morrow óseas humanas	Núcleo de muestras biológicas de WVU		El Centro de Procesamiento de Biomuestras del Centro Oncológico Mary Babb Randolph (MBRCC) y el Banco de Tejidos del Departamento de Patología de la Universidad de Virginia Occidental proporcionaron células de procesamiento de muestras biológicas para la leucemia humana primaria y células estromales de médula ósea (BMSC) no identificadas
Células leucémicas
Reh	ATCC	ATCC-CRL-8286	Las células REH se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y los medios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Los SD-1 se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y los medios recomendados.