Recolección de subpoblaciones leucémicas: un método para la separación espacial de subpoblaciones de células leucémicas a partir del cocultivo 2D

Resumen

Fuente: Slone, W. L., et al. Modelando la leucemia resistente a la quimioterapia in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe un método para la separación espacial de tres subpoblaciones de células leucémicas: las células leucémicas suspendidas que flotan libremente en el medio, las células leucémicas brillantes en fase adheridas a la superficie de la monocapa de células estromales mesenquimales, y las células leucémicas en fase diminutas que han migrado debajo de la monocapa de células estromales mesenquimales desde el cocultivo 2D.

Protocolo

1. Separando 3 subpoblaciones dentro de la co-cultura

1. Colección de la subpoblación de tumores en suspensión (S).
   1. Aspire los medios de la placa de cocultivo con una pipeta y vuelva a aplicar suavemente los mismos medios para enjuagar la placa y recoger los medios que contengan células leucémicas en un tubo cónico de 15 ml. Las células leucémicas recolectadas pertenecen a la subpoblación S.
2. Colección de la subpoblación tumoral de fase brillante (PB).
   1. Vuelva a añadir 10 ml de medios frescos en la placa de cocultivo. Enjuague vigorosamente pipeteando los medios agregados hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5 veces para eliminar las células leucémicas adheridas, pero no lo suficientemente fuerte como para desalojar el componente adherente de BMSC/OB.
   2. Aspirar con pipeta y recoger el medio en un tubo cónico de 15 ml. Las células recolectadas son la subpoblación PB.
3. Colección de la subpoblación tumoral en fase Dim (PD).
   1. Enjuague la placa con 1 ml de PBS para eliminar los medios restantes. Tripsinizar la placa de cocultivo con 3 ml de tripsina y colocarla en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
   2. Retire la placa de la incubadora y golpee suavemente los lados de la placa para desalojar el BMSC/OB adherente.
   3. Agregue 1 ml de suero fetal bovino (FBS) y pipetea hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para romper los agregados de células grandes.
   4. Recoja los medios con células en un tubo cónico de 15 ml. Estas células son la subpoblación de EP no purificada con BMSC/OB también.
4. Centrifugar 3 subpoblaciones aisladas a 400 x g durante 7 min. Aspirar y desechar el sobrenadante y luego resuspender individualmente los gránulos en 1 ml de medio precalentado. Las celdas están listas para cargarse en una columna G10.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	Productos médicos en todo el mundo	41021039	Solución conservante para Muestras de citología
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	Novacyt	Na	Se utiliza para la recolección de células
Suero Fetal Bovino	sigma	F6178
0.05% Tripsina	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
Placas de cultivo celular de 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	664160
Medios de cultivo
Medios de cultivo de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para medios osteoblásticos humanos
Medios RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Para la preparación de medios tumorales
Líneas celulares
Osteoblastos humanos	PromoCell	C-12720	Los osteoblastos humanos se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Células estromales de Morrow óseas humanas	Núcleo de muestras biológicas de WVU		El Centro de Procesamiento de Biomuestras del Centro Oncológico Mary Babb Randolph (MBRCC) y el Banco de Tejidos del Departamento de Patología de la Universidad de Virginia Occidental proporcionaron células estromales de leucemia humana primaria y células estromales de médula ósea (BMSC) no identificadas. Los cultivos de BMSC se establecieron como se describió anteriormente (*)
Células leucémicas
Reh	ATCC	ATCC-CRL-8286	Las células REH se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y los medios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Los SD-1 se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y los medios recomendados.