Recolección de subpoblaciones leucémicas: un método para la separación espacial de subpoblaciones de células leucémicas a partir del cocultivo 2D

1. Separando 3 subpoblaciones dentro de la co-cultura

1. Colección de la subpoblación de tumores en suspensión (S).
   1. Aspire los medios de la placa de cocultivo con una pipeta y vuelva a aplicar suavemente los mismos medios para enjuagar la placa y recoger los medios que contengan células leucémicas en un tubo cónico de 15 ml. Las células leucémicas recolectadas pertenecen a la subpoblación S.
2. Colección de la subpoblación tumoral de fase brillante (PB).
   1. Vuelva a añadir 10 ml de medios frescos en la placa de cocultivo. Enjuague vigorosamente pipeteando los medios agregados hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5 veces para eliminar las células leucémicas adheridas, pero no lo suficientemente fuerte como para desalojar el componente adherente de BMSC/OB.
   2. Aspirar con pipeta y recoger el medio en un tubo cónico de 15 ml. Las células recolectadas son la subpoblación PB.
3. Colección de la subpoblación tumoral en fase Dim (PD).
   1. Enjuague la placa con 1 ml de PBS para eliminar los medios restantes. Tripsinizar la placa de cocultivo con 3 ml de tripsina y colocarla en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
   2. Retire la placa de la incubadora y golpee suavemente los lados de la placa para desalojar el BMSC/OB adherente.
   3. Agregue 1 ml de suero fetal bovino (FBS) y pipetea hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para romper los agregados de células grandes.
   4. Recoja los medios con células en un tubo cónico de 15 ml. Estas células son la subpoblación de EP no purificada con BMSC/OB también.
4. Centrifugar 3 subpoblaciones aisladas a 400 x g durante 7 min. Aspirar y desechar el sobrenadante y luego resuspender individualmente los gránulos en 1 ml de medio precalentado. Las celdas están listas para cargarse en una columna G10.