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1. Carga de células de cocultivo en la columna G10
NOTA: Asegúrese de que la llave de paso esté completamente cerrada antes de agregar medios que contengan celdas a la columna G10. Además, cada subpoblación debe pasarse por una columna G10 separada para no introducir ningún sesgo entre las poblaciones en el análisis posterior.
- Con una pipeta de 1.000 μl, añada 1 ml de cada subpoblación de células en medios precalentados a una columna G10 separada gota a gota. Asegúrese de que el medio que contiene las células permanezca en la parte superior o dentro del pellet G10. Deje que las células se incuben en gránulos G10 durante 20 minutos a RT.
nota: La llave de paso permanece cerrada durante la incubación.
>2. Recolección de células leucémicas de la columna G10
- Añada 1-3 ml de medios precalentados a cada columna G10. Abra la válvula de llave de paso y permita que el medio salga lentamente de la columna gota abajo.
nota: Es crucial mantener un caudal lento de la columna o el gránulo G10 que contiene BMSC/OB puede salir de la columna y contaminar las células leucémicas aisladas.
- Continúe agregando medios precalentados en pequeños incrementos (1-2 ml) a la columna G10 hasta que un total de 15 a 20 ml haya pasado por la columna y se haya recogido. Cierre la válvula de llave de paso y el tubo de recolección de tapones.
nota: Si se ve un gránulo de partículas G10 en el fondo del tubo de recolección, retire suavemente el medio del tubo dejando el gránulo de partículas G10 intacto y transfiéralo al tubo nuevo.
- Centrifugar el medio recogido a 400 x g durante 7 min en RT. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en un tampón adecuado para la aplicación posterior.
- Las células son ahora una población pura de células leucémicas libres de contaminación por BMSC u OB y están listas para ser aplicadas a aplicaciones posteriores a discreción del usuario.
NOTA: La viabilidad de las células leucémicas debe permanecer sin cambios al pasar las células a través de las columnas G10.