Muestreo de sangre retroorbital: un método para aislar células mononucleares del seno retroorbital de un ratón

Resumen

Fuente: Mopin A. et al. Un protocolo detallado para caracterizar la línea celular murina C1498 y su modelo de ratón de leucemia asociada. J. Vis. Exp. (2016)

El video describe un método de muestreo para la recolección de sangre periférica del seno retroorbitario de un ratón y el posterior aislamiento de células mononucleares de la sangre con centrifugación en gradiente de densidad.

Protocolo

1. Retro Recolección de sangre orbital

1. Realizar la extracción de sangre retroorbitaria justo antes de la eutanasia en condiciones estériles en una campana de flujo laminar y bajo una lámpara de calentamiento para prevenir la hipotermia.
2. Para la anestesia, use ketamina a 150 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg. Prepare la solución anestésica diluyendo 1,5 ml de ketamina y 0,5 ml de xilacina en 18 ml de solución de PBS.
3. Inserte un tubo capilar en el canto medial del ojo. La sangre ascenderá desde el seno orbitario hasta el tubo capilar. Controle el sangrado aplicando suavemente presión sobre el ojo con una esponja de gasa estéril.
   nota: Con esta técnica se puede recolectar un volumen de 100 a 200 μl de sangre.
4. Recoja la sangre en un tubo de EDTA y almacene la muestra en hielo antes de aislar las células mononucleares.

>2. Aislamiento de células mononucleares sanguíneas

1. Transfiera la muestra de sangre (de 100 a 200 μl; obtenida en el paso 1.1) a un tubo de microcentrífuga y agregue una solución de PBS/1 mM de EDTA hasta que el volumen de la solución sea de 500 μl. Coloque cuidadosamente 500 μl de solución de separación debajo de la solución que contiene la sangre con una aguja de 30G y una jeringa de 1 ml. No mezcle la sangre y la solución separadora.
2. Centrifugar los tubos a 800 x g (sin freno) durante 20 min a RT. Después de la centrifugación, recoja el anillo celular (la capa blanca opaca) con una pipeta. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga.
   nota: La capa blanca opaca contiene linfocitos y monocitos y aparece entre la capa inferior, la solución separadora, y la capa superior.
3. Añadir 1 ml de solución de PBS y centrifugar el tubo a 350 x g durante 10 min. Vuelva a suspender las células en 600 μl de tampón FACS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamina 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3.59713E+12
Xilacina SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
Solución de PBS (1x concentrado)	ThermoFisher Scientific	Año 14190
Solución ultrapura de EDTA 0,5 M, pH 8,0	ThermoFisher Scientific	15575
Solución separadora (Pancoll Mouse)	PANBIOTECH	P04-64100
Tubo de EDTA	Greiner Bio-One	454034
Pipeta Pasteur 150 mm (tubo capilar)	Marca Pescadora	Llame al 1154-6963
Tubos de citometría de flujo (azul)	Beckman Coulter	2523749
Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
Esponjas de gasa estériles	URGO	501580
Aguja de 30 G	Becton y Dickinson	304000
Jeringa de 1 ml	Terumo	SS-01T
Citocentrífuga Shandon Cytospin 3	ThermoFisher Scientific