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1. Caracterización in vitro de la línea celular C1498
- Cultivo in vitro de células C1498
- Prepare el medio RPMI completo (Roswell Park Memorial Institute) 1640 añadiendo 50 ml de suero fetal bovino (FBS), 5 ml de penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (100 μg/ml), 500 μl de 50 mM de β-mercaptoetanol, 5 ml de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES), 5 ml de aminoácidos no esenciales y 5 mL de piruvato de sodio a 500 ml de medio RPMI.
- Hacer crecer la línea celular C1498 en RPMI completo. Recoja las células en suspensión mediante pipeteo y transfiera las células a un tubo de 50 ml. Centrifugar a 350 x g durante 10 min, y retirar el sobrenadante.
- Añadir 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x), centrifugar a 350 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de tampón clasificador de células activadas por fluorescencia (FACs) (2,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en polvo y 2 ml de solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M en 500 ml de solución de PBS). Cuente las células utilizando una cámara de recuento de células Thoma después de teñir las células con azul de tripano.
2. Preparación de una suspensión celular en portaobjetos para microscopía
- Lave dos veces 106 de las células C1498 recolectadas (obtenidas en el paso 1.1.4) con 5 ml de tampón FAC frío y diluya las células en 1 ml de tampón FAC frío. Coloque los tubos sobre hielo.
- Coloque los portaobjetos en cámaras desechables con tarjetas de filtro preconectadas y colóquelas en una citocentrífuga.
- Añada 100 μl de tampón FACs a cada cámara y tarjeta de filtro, y gírelas durante 2 minutos a 4,52 x g.
- Agregue 100 μl de celdas a cada cámara y tarjeta de filtro, y gire las celdas a 4,52 x g durante 2 min.
- Retire con cuidado los portaobjetos de las cámaras y séquelos al aire antes de teñirlos con el tinte May-Grünwald Giemsa.
3. Tinción de May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Teñir las células (preparadas en la sección 2) sumergiendo los portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga solución de May-Grünwald durante 3 min.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga la solución tampón de pH 6.8 durante 1 min.
- Teñir los portaobjetos colocándolos en un frasco Coplin que contenga la solución de Giemsa R (diluida a 1/20 en solución tampón de pH 6,8) durante 10 min. Lavar los portaobjetos con agua neutra (pH 7) durante 10 segundos.
- Drene y seque al aire los portaobjetos. Monte las correderas aplicando una gota de medio de montaje 2 sobre las celdas. Coloque un borde del cubreobjetos en el portaobjetos y bájelo con cuidado sobre las celdas con pinzas. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire.