Centrifugación en gradiente de densidad: un método para aislar células de LLC de sangre periférica

Abstract

Fuente: Hay, J. et al. Fraccionamiento subcelular de células de leucemia linfocítica crónica primaria para monitorear el tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica para aislar las células de leucemia linfocítica crónica (LLC) de la sangre periférica. Con este protocolo, aislaremos células de LLC de muestras de sangre de pacientes humanos para la posterior generación eficiente de fracciones nucleares y citoplasmáticas.

Protocol

1. Aislamiento de células de LLC a partir de muestras de sangre de pacientes

1. Las muestras de sangre periférica de pacientes con LLC previamente consentidas se reciben de la clínica en tubos de recolección de sangre con EDTA, acompañadas del recuento de glóbulos blancos (WCC). Purificar las muestras de CLL de sangre periférica según el CMI. Para WCC < 40 x 10⁶ células/mL, continúe con el paso 1.1.1; para WCC ≥ 40 x 10⁶ células/mL, continúe con el paso 1.1.2.
   1. Vierta el contenido de todos los tubos de sangre de EDTA en un tubo centrífugo cónico de 50 ml y agregue 50 μl de cóctel de enriquecimiento de células B humanas por 1 ml de sangre. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 20 min. Continúe con el paso 1.1.2.
   2. Diluir la muestra en una proporción de 1:1 con tampón de lavado RT CLL (solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,5% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de EDTA).
2. Medios de gradiente de densidad RT alícuota en un tubo de centrífuga cónico de tamaño adecuado para la muestra (10 mL en un tubo de 50 mL para 30 mL de muestra o 4 mL en un tubo de 15 mL para 10 mL de muestra).
3. Coloque cuidadosamente la muestra en capas sobre el medio de gradiente de densidad y centrifuga a 400 x g durante 30 min a RT.
   NOTA: Asegúrese de que la centrífuga esté en RT antes de colocar las muestras en la centrífuga, ya que un cambio en la temperatura dará como resultado un enriquecimiento deficiente de las celdas mononucleares, y apague el freno de la centrífuga, ya que un frenado repentino puede interrumpir la interfaz líquida.
4. Coseche suavemente la capa blanca de células mononucleares que se acumulan en la interfaz del medio de gradiente de densidad y el tampón de lavado de LLC, en un tubo de centrífuga cónico fresco de 50 ml utilizando una pipeta Pasteur de plástico.
5. Agregue 40 mL de tampón de lavado de CLL a la monocapa aislada para lavar las celdas y centrifugue a 300 x g durante 10 min en RT.
6. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet moviendo la parte inferior del tubo, luego repita el paso de lavado descrito en el paso 1.5.
7. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet como se describe en el paso 1.6 y, a continuación, vuelva a suspender el pellet en un volumen determinado de tampón de lavado CLL (hasta 40 ml, dependiendo del tamaño del pellet de la celda).
8. Recuento de las células con azul de tripán y un hemocitómetro. A continuación, proceda a la citometría de flujo para comprobar la pureza de las células de LLC.
   NOTA: En esta etapa, las células de LLC se pueden cultivar a una concentración de 10 x 10⁶ células/mL en medios para ser utilizados en experimentos, y/o criopreservadas en dimetilsulfóxido (DMSO)/FBS al 10% para trabajos futuros a concentraciones de hasta 100 x 10⁶ células/vial.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de 15 mL	Griener Bio uno	188271
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Griener Bio uno	616201
Dmso	sigma	D2650
EDTA	sigma	Eds
Suero Fetal Bovino	Termopescador	10500064
Medios de gradiente de densidad Histopaque1077	sigma	H8889
Solución de Trypan Blue	Termopescador	15250061
Tabletas PBS	Fisher Científico	BR0014G
RosetteSep Cóctel de enriquecimiento de células B humanas	Tecnologías de células madre	Año 15064
Sigma 3-16P	SciQuip		centrífuga