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1. Preparación de fracciones subcelulares a partir de células CLL
NOTA: Al planificar la configuración experimental, incluya un pocillo de células no estimuladas/no tratadas a partir de las cuales se pueda generar el extracto celular completo.
- Realizar la estimulación y/o el tratamiento farmacológico deseado de la línea celular de LLC MEC1 o de las células primarias aisladas de LLC utilizando 10 – 20 x 106 células/condición. A continuación, las células se utilizarán para el fraccionamiento subcelular o para generar un extracto de célula entera, como se explica a continuación:
- Preparación de soluciones/tubos: Prepare todas las soluciones/tampones frescos el día del fraccionamiento antes de que se recolecten las células. Guarde las soluciones en hielo hasta que se necesiten y utilícelas dentro de las 4 horas posteriores a la preparación.
- Solución de PBS/inhibidor de la fosfatasa: Prepare los inhibidores de la fosfatasa en PBS diluyendo los inhibidores de la fosfatasa 1:20 en 1x PBS (es decir, 0,5 mL de inhibidores de la fosfatasa en 9,5 mL de 1x PBS)
nota: Asegúrese de que los inhibidores de la fosfatasa no se hayan precipitado. Si hay precipitado, calentar a 50 °C durante 10 min.
- Tampón hipotónico: Prepare 1x tampón hipotónico haciendo una dilución 1:10 de tampón hipotónico 10x en agua destilada (es decir, 50 μL de tampón hipotónico 10x en 450 μ L de dH2O).
- 10 mM de ditiotreitol (DTT): Prepare 10 mM de DTT haciendo una dilución 1:100 de 1M de DTT con agua destilada (es decir, 10 μL de 1 M de DTT en 990 μL de dH2O).
nota: La TDT es muy lábil, así que prepárala fresca cada vez. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación.
- Tampón de lisis completo: determine la cantidad de tampón que se requiere para cada experimento. Cada muestra requiere 50 μL de tampón de lisis completo, por lo que se deben añadir 5 μL de 10 mM de DTT a 44,5 μL de tampón de lisis y, a continuación, añadir 0,5 μL de cóctel de inhibidores de proteasa. Esta cantidad se puede aumentar en función del número de muestras del experimento.
- Etiquete cuatro juegos de tubos de microfuga de 1,5 mL para cada estimulación y/o tratamiento farmacológico para las células recién estimuladas, las fracciones citoplasmáticas recién generadas, las fracciones nucleares recién generadas y los lisados de células completas. Enfríe previamente estos tubos de microfuga en hielo hasta que se necesiten.
- Transfiera las células a tubos de microfuga de 1,5 mL marcados individualmente y granule centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de inhibidores de PBS/fosfatasa fríos como hielo. Granular las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y mantener las células en hielo.
- Preparación de fracciones citoplasmáticas: Resuspender suavemente los gránulos celulares que se utilizarán para el fraccionamiento subcelular en 50 μL de 1x tampón hipotónico. Incube las células en hielo durante 15 minutos para permitir que las células se hinchen.
nota: El volumen de tampón hipotónico utilizado se puede aumentar empíricamente en función del número de células.
- Añada de 0,8 a 2,5 μL (1:20 a 1:60) de detergente en cada muestra y vórtice en el ajuste más alto durante 10 s.
- Para determinar la concentración óptima de detergente a utilizar para un tipo de célula específica para aislar fracciones nucleares y citoplasmáticas, realice inicialmente un gradiente de detergente. Un rango de 1:20 a 1:60 (es decir, 2,5 μL a 0,8 μL de detergente en 50 μL de tampón hipotónico) debería ser adecuado.
nota: Si se ajusta el volumen de tampón hipotónico en el paso 3.4, asegúrese de mantener la proporción de detergente adecuada.
- Verifique la lisis celular observando las células con un microscopio de contraste de fase antes y después de la adición de detergente. Las células enteras parecen más grandes con un núcleo denso y oscuro. El citoplasma aparecerá como un halo brillante alrededor del núcleo.
nota: La lisis apropiada se confirma aún más mediante el uso de Western blot para analizar proteínas específicas dentro de las fracciones lisadas generadas a partir del gradiente de detergente.
- Una vez lisadas, centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 30 s a 4 °C.
- Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo de microfuga preenfriado y etiquetado. Esta fracción citoplasmática puede almacenarse a -80 °C hasta que sea necesario para su posterior análisis. El pellet restante contiene la fracción nuclear.
nota: Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación de las muestras.
- Preparación de fracciones nucleares: Vuelva a suspender cada pellet nuclear en 50 μL de tampón de lisis completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
NOTA: El volumen del tampón de lisis completo se puede ajustar empíricamente de acuerdo con el número de celda inicial.
- Añadir 2,5 μL de detergente para solubilizar las proteínas asociadas con la membrana nuclear y el vórtice en la configuración más alta durante 10 s. Incubar las muestras en hielo durante 30 min.
- Vértice en la posición más alta durante 30 s, luego centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga preenfriado y etiquetado. Esta fracción nuclear puede almacenarse a -80 °C hasta que sea necesario para su posterior análisis.
nota: Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación de las muestras.