1. Preparación de reactivos
- Prepare 500 mL de PBS disolviendo 137 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 4.3 mM de Na2HPO4, 1.47 mM de KH2PO4, en ddH2O. Ajuste el pH a 7.4 con HCl. Esterilizar en autoclave.
- Preparar 100 mL de medio RPMI: Medio RPMI-1640 con L-Alanil-Glutamina suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL).
- Preparar 50 mL de NaHCO3 0,1 M en agua destilada. Ajustar el pH a 8,1, esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a 4 °C.
nota: Para dos placas analizadoras de flujo extracelular de 8 pocillos, prepare 250 μL de NaHCO3 de 0,1 M pH 8,1.
- Prepare 1 mL de 2 M D-glucosa en agua destilada. Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Prepare 100 μL de 1 mM de oligomicina A en etanol. Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Prepare 250 μL de 1 M de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) en DMEM mínimo (medio del águila modificada de Dulbecco). Calentar a 37 °C y ajustar el pH a 7,4 (realizar la medición del pH a 37 °C). Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Prepare 100 μL de 1 mM de FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona) en DMSO. Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Prepare 100 μL de 1 mM de rotenona en etanol. Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Prepare 100 μL de 1 mg/mL de Antimicina A en etanol. Esterilizar con filtro (0,22 μm) y almacenar a -20 °C.
- Justo antes de usar, prepare 10 ml de medio de prueba de esfuerzo de glucólisis. Calentar el DMEM mínimo a 37 °C en un baño de agua y ajustar el pH a 7,4 (realizar la medición del pH a 37 °C).
- Antes de usar, prepare 10 mL de medio de prueba de esfuerzo Cell Mito con BSA. Complemente Minimal DMEM con 2 mM de L-glutamina, 10 mM de D-glucosa, 1 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de piruvato y 0,1 % de BSA (albúmina sérica bovina). Calentar a 37 °C en un baño de agua y ajustar el pH a 7,4 (realizar la medición del pH a 37 °C).
- Antes de usar, prepare 10 mL de medio de prueba de esfuerzo Cell Mito sin BSA. Complemente Minimal DMEM con 2 mM de L-glutamina, 10 mM de D-glucosa, 1 mM de HEPES (pH 7,4) y 1 mM de piruvato. Medio de prueba de esfuerzo Warm Cell Mito sin BSA a 37 °C en un baño de agua y ajuste el pH a 7.4 (realice la medición del pH a 37 °C).
NOTA: BSA se agrega al medio de prueba de esfuerzo Cell Mito porque las células responden mejor a FCCP cuando el medio se complementa con BSA (se probaron diferentes condiciones). El medio de prueba de esfuerzo Cell Mito sin BSA se utiliza para cargar los puertos, ya que el fabricante no recomienda el uso de BSA en el medio.
2. Cultivo nocturno de células mononucleares
NOTA: Realice todos los subpasos en una campana de cultivo de tejidos estéril.
- Prepare dos matraces T75 con 20 mL de RPMI. A cada matraz, añada 30 x 106 células mononucleares aisladas. Incubar las células con el matraz en posición vertical durante 16-24 h al 5% de CO2 y 37 °C.
3. Preparación de placas recubiertas de adhesivo celular
- Recubrimiento de dos placas analizadoras de flujo extracelular de 8 pocillos.
nota: Realice el recubrimiento en una campana de cultivo de tejidos estéril.
- Añadir 2,2 μL de adhesivo celular (densidad: 2,54 mg/ml) a 250 μL de NaHCO3 0,1 M, pH 8,1, y pipetear inmediatamente 12,5 μL de la solución en cada pocillo.
nota: Las soluciones madre adhesivas celulares pueden diferir en su densidad, ajuste el volumen agregado a NaHCO3 en consecuencia.
- Deje reposar las placas en la campana durante unos 20 minutos, luego aspire el adhesivo celular y lave cada pocillo dos veces con 200 μL de agua estéril. Déjalo reposar en la campana con la tapa abierta hasta que los pozos estén secos.
- Utilice las placas de inmediato o guarde hasta 1 semana a 4 °C con el borde envuelto en una película de parafina para evitar la condensación. Asegúrese de que las placas se calienten a temperatura ambiente (durante unos 20 minutos) en la campana antes de sembrar las celdas.
4. Hidratación del cartucho sensor
NOTA: Hidrate dos cartuchos de analizador de flujo extracelular de 8 pocillos.
- Separe la placa de utilidad y el cartucho del sensor. Coloque el cartucho del sensor boca abajo en la mesa de laboratorio.
- Llene cada pocillo de la placa utilitaria con 200 μL de calibrante. Llene cada foso alrededor del exterior de los pozos con 400 μL de calibrante.
- Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad que ahora contiene el calibrante.
- Coloque el conjunto de cartucho en una incubadora humidificada, sin CO2, a 37 °C durante la noche.
- Encienda el analizador de flujo extracelular y deje que se caliente a 37 °C durante la noche.
5. Células de siembra en placas recubiertas de adhesivo de células
NOTA: Para la prueba de esfuerzo de glucólisis, utilice el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis. Para la prueba de esfuerzo Cell Mito, use el medio de prueba de esfuerzo Cell Mito con BSA.
- Células semilla para la prueba de esfuerzo de glucólisis y la prueba de esfuerzo de Cell Mito en placas separadas. Para cada prueba, use células de un matraz con cultivo durante la noche.
- Centrifugar las celdas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en 1 ml del medio adecuado y cuéntelas.
- Añadir 4 x 106 de células vivas hasta el volumen final de 400 μL (utilizar un medio adecuado).
- Placa 50 μL de la suspensión celular en los pocillos B-G. Asegúrese de que 500.000 células estén sembradas en un pocillo.
nota: Es crucial sembrar exactamente 500.000 células por pozo, ya que no se realiza ninguna otra normalización. De esa manera, se pueden comparar los resultados de diferentes pacientes. El número óptimo de réplicas es seis, como se describe aquí. No se recomienda utilizar menos réplicas, ya que las células primarias a veces podrían comportarse de forma errónea.
- Agregue 180 μL del medio apropiado en los pocillos A y H (estos pocillos servirán como corrección de fondo).
- Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente con el freno puesto en 1.
- Agregue 130 μL de medio apropiado a los pocillos B-G en dos placas analizadoras de flujo extracelular de 8 pocillos lenta y cuidadosamente. Confirme visualmente que las células están adheridas de manera estable al fondo de los pocillos observándolas bajo el microscopio.
- Coloque la placa en una incubadora humidificada, sin CO2, a 37 °C durante 30 min.
6. Cargando el cartucho del sensor
- Para la prueba de esfuerzo de glucólisis, prepare 250 μL de 100 mM de glucosa, 20 μM de oligomicina A y 1 M 2-DG, todos en medio de prueba de esfuerzo de glucólisis.
- Para la prueba de esfuerzo Cell Mito, prepare 250 μL de 20 μM de oligomicina A, 15 μM de FCCP, 30 μM de FCCP y una mezcla de 10 μM de rotenona y 10 μg/ml de antimicina A, todo en un medio de prueba de esfuerzo Cell Mito sin BSA.
nota: Se recomienda inyectar dos concentraciones de FCCP en un ensayo, ya que no hay suficiente material para los pacientes para la titulación de FCCP. Sin embargo, las concentraciones deben ser determinadas por el investigador.
- Cargue los compuestos en los puertos de inyector apropiados del cartucho de la siguiente manera (Tabla 1):
7. Configuración del programa
- Para la prueba de esfuerzo de glucólisis, configure el programa como se describe en la Tabla 2.
- Para la prueba de esfuerzo Cell Mito, configure el programa como se describe en la Tabla 3.
- Inicie el programa. Reemplace la placa de calibración con la placa de ensayo (cuando se le solicite).
| puerto | Prueba de esfuerzo de glucólisis | >Prueba de esfuerzo mito de celda |
| Cargar en el puerto | Concentración final en los pozos | Cargar en el puerto | Concentración final en los pozos |
| un | 20 μL de 100 mM de glucosa | 10 mM de glucosa | 20 μL de 20 μM de oligomicina A | 2 μM de oligomicina A |
| B | 22 μL de 20 μM de oligomicina A | 2 μM de oligomicina A | 22 μL de 15 μM de FCCP | 1,5 μM FCCP |
| C | 25 μL de 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL de FCCP de 30 μM | FCCP de 4,5 μM |
| D | X | | 25 μL de 10 μM de rotenona y 10 μg/ml de antimicina A | 1 μM de rotenona y 1 μg/ml de antimicina A |
Tabla 1: Volúmenes compuestos.
| paso | Configuración |
| calibración | Automático |
| Equilibrado | Automático |
| Medición de línea de base | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto A | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto B | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto C | inyección |
| medición | Cuatro veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
Tabla 2: Programa para la prueba de esfuerzo de glucólisis.
| paso | Configuración |
| calibración | Automático |
| Equilibrado | Automático |
| Medición de línea de base | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto A | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto B | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto C | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Inyección del puerto D | inyección |
| medición | Tres veces: Mezclar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
Tabla 3: Programa para la prueba de esfuerzo Cell Mito.
