Enriquecimiento de células T: una técnica para aislar células T de una población de células mixtas mediante separación magnética

Resumen

Fuente: Nguyen, H. D., et al. Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped. J. Vis. Exp. (2020).

Este video describe el enriquecimiento de células T del bazo de un ratón mediante selección negativa utilizando un separador magnético. La técnica consiste en dirigirse a las otras células de la muestra para su agotamiento mediante el uso de anticuerpos o ligandos dirigidos contra antígenos específicos de la superficie celular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Día 1: Preparación de células T a partir de los ratones donantes

1. Utilice ratones de tipo salvaje (WT) CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 como donantes de células T.
2. Eutanasiar ratones C57BL/6 por asfixia con dióxido de carbono (CO₂) y esperar 2-3 minutos hasta que estén inconscientes. Realizar la luxación cervical como eutanasia secundaria si es necesario.
3. Limpie a fondo el pelaje y la piel del ratón con etanol al 70%. Extirpar el bazo y los ganglios linfáticos y separarlos en una suspensión unicelular de esplenocitos utilizando un émbolo de jeringa y filtros de malla de 40 μm. Lave el colador y el émbolo de la jeringa con 1% de RPMI (1% de FBS que contiene medios RPMI) para recoger todos los esplenocitos.
4. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Añadir 5 mL de tampón de lisado ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) después de desechar el sobrenadante. Incubar la suspensión celular durante 5 min a temperatura ambiente.
   nota: El tampón de lisis ACK se utiliza para lisar glóbulos rojos.
5. Agregue 5 mL de RPMI al 1% para detener la lisis. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
6. Prepare un tampón de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) helado (0,5% BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7,2). Desgasifique el tampón antes de usarlo. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 5 mL de tampón MACS.
7. Cuente los esplenocitos y verifique las células vivas y muertas con un hemocitómetro y azul de tripán al 1%. Guarde una alícuota de 2 x 10⁶ celdas para evaluar el rendimiento de purificación con el análisis de citometría de flujo.
8. Resuspender los esplenocitos a la concentración de 200 x 10⁶/mL en tampón MACS. Añadir 0,03 μL de biotina anti-ratón-Ter-119, 0,03 μL de biotina anti-ratón-CD11b, 0,03 μL de biotina anti-ratón-CD45R y 0,03 μL de biotina anti-ratón-DX5 por cada 10⁶ células. Incubar durante 15 min a 4 °C.
   nota: Se utilizaron biotina anti-ratón-Ter-119, biotina anti-ratón-CD11b, biotina anti-ratón-CD45R y biotina anti-ratón-DX5 para reaccionar con eritroides, granulocitos, células B y células NK, respectivamente. Por lo tanto, estos subconjuntos de celdas se agotan en el siguiente paso.
9. Agregue 10 ml de tampón MACS helado a la suspensión celular. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
10. Vuelva a suspender los gránulos celulares en el tampón MACS a una concentración de 100 x 10⁶/mL. Añadir microesferas anti-biotina (0,22 μL/10⁶ células) a la suspensión de esplenocitos. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos más a 4 °C. Lave la suspensión celular una vez con 10 ml de tampón MACS helado. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
11. Coloque una columna de separación magnética en el campo magnético. Enjuague la columna con 3 mL de tampón MACS. Deje caer la suspensión de la celda sobre la columna. Recoja el flujo continuo que consiste en células T enriquecidas no unidas, en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Lave la columna MS con 3 mL de tampón MACS helado.
    nota: Asegúrese de que la columna esté vacía antes de realizar los pasos de lavado.
12. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de tampón MACS.
13. Cuente las células en azul de tripán al 1% usando un hemocitómetro. Guarde una alícuota de 2 x 10⁶ celdas para una verificación de pureza por citometría de flujo.
    nota: El rendimiento promedio de células T esplénicas aisladas por este método es de ~ 20-25 x 10⁶ células por ratón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	Medio
MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302	Enriquecimiento de células T
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Fisher Científico	BP2482100	Búfer MACS
10 veces PBS	Fisher Científico	BP3994	Búfer MACS
Microperlas anti-biotina	Miltenyi Biotec	130-090-485	Enriquecimiento de células T
Anti-Humano/Ratón CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	13-0452-85	Enriquecimiento de células T
Biotina CD4 anti-ratón	Thermo Fisher Scientific	13-0041-86	Enriquecimiento de células T
CD11b	Thermo Fisher Scientific	13-0112-85	Enriquecimiento de células T
Biotina CD25	Thermo Fisher Scientific	Teléfono 13-0251-82	Enriquecimiento de células T
CD45R	Thermo Fisher Scientific	13-0452-82	Enriquecimiento de células T
Anticuerpo monoclonal CD49b (DX5)-biotina	Thermo Fisher Scientific	Teléfono 13-5971-82	Enriquecimiento de células T
Biotina anti-ratón TER-119	Thermo Fisher Scientific	13-5921-85	Enriquecimiento de células T
Anti-ratón CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientific	12-0900-83	Análisis de citometría de flujo
Ratones C57BL/6	Río Charles	27	Donantes/Receptores
Tubos de citometría de flujo	Fisher Científico	352008	Análisis de citometría de flujo
Filtro de celdas 40 uM	Thermo Fisher Scientific	22363547	Preparación de células