Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

1. Generar células dendríticas derivadas de la médula ósea (BM-DCs).

1. Aísle la médula ósea de los fémures y tibias de ratones WT o factor B (fB)^-/- en el fondo B6. Brevemente, recoge la tibia y el fémur de ambas piernas con pinzas y tijeras. Colóquelos en RPMI helados que contengan 1% de FCS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina (1% RPMI) en tubos cónicos de 50 mL. Limpie a fondo el fémur y los huesos de la tibia eliminando todos los tejidos musculares con pinzas y tijeras. Transfiera el fémur y la tibia de los tubos cónicos de 50 mL a una placa de Petri de 92 mm de diámetro que contenga 1% de RPMI. Con unas tijeras, corte los extremos del fémur o la tibia. Llene un tubo de 50 mL con 25 mL de medio RPMI 1640 al 1%. Úselo para llenar una jeringa de 3 mL conectada a una aguja de 26 G con 3 mL de RPMI al 1%. Inserte esta jeringa en el hueso y empuje el émbolo para expulsar la médula ósea (BM) de la cavidad y colocarla en el tubo de recolección con 1% de RPMI (~3 mL/hueso). Gira las celdas a 800 x g durante 5 min.
2. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de tampón de lisado ACK para la lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular durante 5 minutos en hielo. Añadir 10 mL de RPMI al 1% a la suspensión celular para detener la lisis y centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
3. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 10 mL de medio de cultivo (RPMI 1640 que contiene 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM de l-glutamina y 50 mM de β-mercaptoetanol) y ajuste el volumen para cumplir con la concentración final de 2 x 10⁶ células/mL.
4. Añadir 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) a la suspensión celular. Cultivar las células de médula ósea en placas de Petri de 100 x 15 mm a 37 °C en 5% CO₂ durante 6 días.
5. Reemplace la mitad del medio de cultivo en curso (aproximadamente 5 mL) con un medio nuevo que contenga 40 ng/mL GM-CSF el día 3.
6. Precaliente el medio de cultivo en un baño de agua a 37 °C. Recoja unos 5 mL del medio de las placas de cultivo de médula ósea. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo celular en un medio de cultivo de 5 mL que contenga 40 ng/mL GM-CSF.
7. Añadir 25 μg/mL de lipopolisacárido (LPS) al medio en el día 6 del cultivo para madurar las BM-DCs. Guarde una alícuota de 2 x 10⁶ células para determinar la eficacia de la diferenciación de las CD por citometría de flujo.
8. Recoja BM-DC maduras: Use elevadores de celdas para raspar suavemente las DC de las placas de Petri. Recoja todas las suspensiones celulares en tubos cónicos de 50 mL. Centrifugar a 800 x g, durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Lave los pellets de celda 3 veces con 50 ml de PBS helado. Guarde alrededor de 2 x 10⁶ BM-DC para el análisis del fenotipo inmunológico mediante citometría de flujo.