Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

Resumen

Fuente:Nguyen, H. D., et al. Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped. J. Vis. Exp.. (2020).

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Protocolo

1. Generar células dendríticas derivadas de la médula ósea (BM-DCs).

1. Aísle la médula ósea de los fémures y tibias de ratones WT o factor B (fB)^-/- en el fondo B6. Brevemente, recoge la tibia y el fémur de ambas piernas con pinzas y tijeras. Colóquelos en RPMI helados que contengan 1% de FCS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina (1% RPMI) en tubos cónicos de 50 mL. Limpie a fondo el fémur y los huesos de la tibia eliminando todos los tejidos musculares con pinzas y tijeras. Transfiera el fémur y la tibia de los tubos cónicos de 50 mL a una placa de Petri de 92 mm de diámetro que contenga 1% de RPMI. Con unas tijeras, corte los extremos del fémur o la tibia. Llene un tubo de 50 mL con 25 mL de medio RPMI 1640 al 1%. Úselo para llenar una jeringa de 3 mL conectada a una aguja de 26 G con 3 mL de RPMI al 1%. Inserte esta jeringa en el hueso y empuje el émbolo para expulsar la médula ósea (BM) de la cavidad y colocarla en el tubo de recolección con 1% de RPMI (~3 mL/hueso). Gira las celdas a 800 x g durante 5 min.
2. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de tampón de lisado ACK para la lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular durante 5 minutos en hielo. Añadir 10 mL de RPMI al 1% a la suspensión celular para detener la lisis y centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
3. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 10 mL de medio de cultivo (RPMI 1640 que contiene 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM de l-glutamina y 50 mM de β-mercaptoetanol) y ajuste el volumen para cumplir con la concentración final de 2 x 10⁶ células/mL.
4. Añadir 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) a la suspensión celular. Cultivar las células de médula ósea en placas de Petri de 100 x 15 mm a 37 °C en 5% CO₂ durante 6 días.
5. Reemplace la mitad del medio de cultivo en curso (aproximadamente 5 mL) con un medio nuevo que contenga 40 ng/mL GM-CSF el día 3.
6. Precaliente el medio de cultivo en un baño de agua a 37 °C. Recoja unos 5 mL del medio de las placas de cultivo de médula ósea. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo celular en un medio de cultivo de 5 mL que contenga 40 ng/mL GM-CSF.
7. Añadir 25 μg/mL de lipopolisacárido (LPS) al medio en el día 6 del cultivo para madurar las BM-DCs. Guarde una alícuota de 2 x 10⁶ células para determinar la eficacia de la diferenciación de las CD por citometría de flujo.
8. Recoja BM-DC maduras: Use elevadores de celdas para raspar suavemente las DC de las placas de Petri. Recoja todas las suspensiones celulares en tubos cónicos de 50 mL. Centrifugar a 800 x g, durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Lave los pellets de celda 3 veces con 50 ml de PBS helado. Guarde alrededor de 2 x 10⁶ BM-DC para el análisis del fenotipo inmunológico mediante citometría de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 veces PBS	Fisher Científico	BP3994	Búfer MACS
B6 fB-/- ratones	Universidad de Florida Central	En casa	Destinatarios
B6. Ratones Ly5.1 (CD45.1 + )	Río Charles	546	donantes
Ratones BALB/c	Río Charles	28	Receptores de trasplantes
Ratones C57BL/6	Río Charles	27	Donantes/Receptores
Suero fetal bovino (FBS)	Sistema de investigación y desarrollo de Atlanta Bilogicals	D17051	cultivo celular
Lipopolisacárido (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	DC maduro
Incubadora New Brunswick Galaxy 170R	Eppendorf	Galaxy 170 R	cultivo celular
Penicilina+estreptomicinaPenicilina/ Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococo)	GIBCO	Año 15140	Medio
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	Medio