$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fijación, lisis celular y cizallamiento de la cromatina
NOTA: Las muestras de pacientes y las células Jurkat se fijan y lisan con un kit ChIP disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las modificaciones descritas anteriormente. La fijación se realiza bajo una campana de flujo laminar.
- Prepare un tubo de 1,5 mL con 1 mL de formaldehído al 37%, un tubo de 1,5 mL con 1 mL de glicina 1,25 M, un tubo de 5 mL con 4 mL de 1x PBS y una caja con hielo para la fijación de las células.
- Después de la estimulación de las células durante el tiempo de incubación respectivo, estimule las células agregando 32,4 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 1 μM de ionomicina. A continuación, incubar las células durante 16 h a 37 °C y 5% deCO2 con la tapa del tubo abierta (para evitar la contaminación, se puede utilizar una película de sellado permeable al aire, girar los tubos de 5 mL a 200 x g durante 5 min y resuspender las células en 500 μL de PBS en los tubos de 5 mL.
- Agregue 340 μM de formaldehído (13,5 μL de formaldehído al 37%) a las células. Después de una breve mezcla pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo, incube la suspensión durante 2,5 min (células Jurkat) o 5 min (muestra del paciente) a temperatura ambiente.
nota: Se necesita un tiempo de fijación prolongado para las células primarias para asegurar un cizallamiento óptimo.
- Añadir 125 mM de glicina (57 μL de glicina 1,25 M) para detener la fijación e incubar durante otros 5 min. Poner las células en hielo inmediatamente después y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante por aspiración.
- Lavar las células dos veces con 1 mL de PBS helado a 200 x g durante 5 min a 4 °C y eliminar el sobrenadante cada vez por aspiración.
nota: Después de la fijación, el protocolo se puede pausar. Las celdas fijas deben almacenarse a -80 °C. Para realizar la prueba, si el epítopo del anticuerpo que se pretende utilizar en el siguiente protocolo no se enmascara mediante fijación, se pueden utilizar muestras adicionales para el análisis mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y Western blot. Estos pasos se realizan con 100 μg de proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los anticuerpos αNFAT2 se utilizan en una dilución de 1:1000, el anticuerpo GAPDH en una dilución de 1:10000. En la Figura 1 se muestra una imagen ejemplar de muestras fijas de células Jurkat con anticuerpos apropiados e inapropiados.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de tampón de lisis 1 disponible comercialmente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, coloque las muestras en el hielo de una coctelera e incube durante 10 minutos mientras agita.
nota: Antes de la lisis, las células pueden desintegrarse durante 10 s en nitrógeno líquido. Esto es útil para las células Jurkat, pero debe evitarse en las muestras primarias de pacientes. Para la desintegración, coloque los tubos de 5 mL durante 5 s en 5-10 mL de nitrógeno líquido en un recipiente específico. Use gafas de seguridad y guantes de seguridad adecuados.
- A continuación, centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante con cuidado mediante pipeteo.
- Homogeneizar las células en 5 mL de tampón de lisis 2 disponible en el mercado pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 10 min en hielo mientras se agita. A continuación, centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante con cuidado mediante pipeteo.
- Vuelva a suspender el pellet de células en 500 μL (células Jurkat) o 140 μL (muestras de pacientes) de tampón de cizallamiento 1 que contenga 1x inhibidor de la proteasa (5 μL o 1,4 μL, respectivamente) e incubar la mezcla durante 10 min en hielo.
- Para el cizallamiento de la cromatina, transfiera 140 μL de la suspensión celular del paso 1.9 a los tubos sonicadores (evite producir burbujas de aire y repita este paso si es necesario debido al volumen de la muestra). Colocar los tubos en el ultrasonido enfocado a una temperatura de 7 °C y cizarlos durante 10 min (línea celular) o 7,5 min (muestras de pacientes) con una potencia incidente media de 9,375 W para obtener fragmentos de ADN de 200-500 pb.
- Por último, centrifugar a 15700 x g durante 10 min a 4 °C en la centrífuga pequeña y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
- Para probar los tamaños de fragmento apropiados, analice 20 μL de la cromatina cortada mediante electroforesis en gel de agarosa TBE al 1,5%. En la Figura 2 se muestra una imagen ejemplar de cromatina cortada de células Jurkat de buena y mala calidad. En este punto, el protocolo puede estar potencialmente en pausa. La cromatina cortada debe almacenarse a -80 °C.
