Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

Resumen

Fuente: Fuchs, A. R.,et al. A Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar nuevos genes diana de NFAT2 en la leucemia linfocítica crónica. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe el protocolo para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que es una técnica clásica para demostrar las interacciones proteína-ADN. Esta técnica se utiliza para identificar genes diana en células de leucemia linfocítica crónica humana.

Protocolo

1. Inmunoprecipitación de cromatina

NOTA: La inmunoprecipitación de cromatina se realizó con un kit ChIP disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones.

1. Calcule el número de inmunoprecipitaciones (70 μL (células Jurkat) o 15 μL (muestras de pacientes) de cromatina cortada más un anticuerpo) y prepare 20 μL de perlas recubiertas de proteína A por precipitación en un tubo de 1,5 mL. Lave las perlas en 40 μL de 1x tampón ChIP 1 por precipitación pipeteando hacia arriba y hacia abajo, deje reposar las perlas en una rejilla magnética durante 1 min y elimine el sobrenadante mediante pipeteo. Realice este paso cuatro veces en total. Eventualmente, vuelva a suspender las cuentas en el volumen original con 1x ChIP buffer 1.
2. Para la inmunoprecipitación propiamente dicha, se utilizan 10 μg del anticuerpo αNFAT2 (7A6) para capturar NFAT2 con sus secuencias diana unidas. Utilice 2,5 μg de un anticuerpo IgG de conejo (DA1E) como control de IgG. Prepare las reacciones en tubos frescos de 1,5 mL como se indica en la Tabla 1.
   NOTA: Es importante utilizar un anticuerpo monoclonal de alta afinidad cuyo epítopo no esté enmascarado durante la fijación para este protocolo. Los anticuerpos policlonales introducen un nivel adicional de variación, lo que dificulta significativamente la interpretación adecuada de los resultados recibidos.
3. Incubar la mezcla desde el paso 1.2 durante la noche a 4 °C en una rueda giratoria a 6 rpm.
4. Al día siguiente, gire los tubos durante 5 s a 7.000 x g en la centrífuga pequeña, incube en una gradilla magnética durante 1 min y retire el sobrenadante por aspiración. Lave las perlas una vez con cada uno de los tampones de lavado 1, 2, 3 y 4 consecutivamente.
5. Para ello, vuelva a suspender las perlas en 350 μL de tampón de lavado e incube durante 5 min a 4 °C en una rueda giratoria a 6 rpm.
6. A continuación, haga girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña. A continuación, colócalos durante 1 min en una rejilla magnética, retira el sobrenadante y añade el siguiente tampón de lavado.
7. Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante mediante pipeteo, tome las perlas en 100 μL de tampón de elución 1 e incube durante 30 min en una rueda giratoria a 6 rpm.
8. Gire los tubos brevemente (5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña) y colóquelos en una rejilla magnética durante 1 minuto.
9. A continuación, transfiera el sobrenadante por pipeteo a un nuevo tubo de 1,5 mL y añada 4 μL de tampón de elución 2.
10. Para crear el control de entrada, mezcle 1 μL de la cromatina cortada con 99 μL de tampón de elución 1 y 4 μL de tampón de elución 2 (en esta configuración, hay tres tubos por paciente: un control de entrada, un control de IgG y una muestra de αNFAT2).
11. Incubar las muestras durante 4 h a 65 °C y 1300 rpm en un agitador de tubo de 1,5 mL. Añadir 100 μL de isopropanol al 100%, vórtice y centrifugar las muestras durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña.
12. Vuelva a suspender las perlas magnéticas disponibles mediante un vórtice minucioso, añada 10 μL de las perlas a cada muestra e incube durante 1 h a temperatura ambiente en una rueda giratoria a 6 rpm.
13. Después de la incubación, haga girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña y colóquelos durante 1 minuto en una rejilla magnética. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
14. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de tampón de lavado 1. Invierta los tubos para mezclar e incubar durante 5 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria a 6 rpm.
15. Girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, colocarlos durante 1 min en una rejilla magnética y eliminar el sobrenadante mediante pipeteo. Repita los pasos 2.13-2.14 con el tampón de lavado 2.
16. A continuación, retire el tampón de lavado por aspiración, vuelva a suspender las perlas en 55 μL del tampón de elución e incube durante 15 min a temperatura ambiente en la rueda giratoria a 6 rpm para eluir el ADN precipitado. Finalmente, haga girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, colóquelos durante 1 minuto en una rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos >nota: En este caso, el protocolo puede estar potencialmente en pausa. A continuación, el ADN eluido debe almacenarse a -20 °C.

artículo	volumen (μL) por IP
5% BSA	6
100 x inhibidor de la proteasa	3
5 x Búfer ChIP 1	56
cromatina cortada	x (15 μL o 70 μL)
Perlas magnéticas recubiertas de proteína A	20
Agua de grado ChIP seq	185-x-y
anticuerpo (control de αNFAT2 o IgG)	y (1,09 μL o 1 μL)
total	270

Tabla 1: Calendario de pipeteo de la inmunoprecipitación de cromatina. La inmunoprecipitación de la cromatina se realizó preparando las reacciones como se indica en la tabla.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-NFAT2	Alexis	1008505	Clon 7A6
Anticuerpo anti-NFAT2	Señalización celular	8032S	Clonar D15F1
Anticuerpo anti-NFAT2 Grado ChIP	Abcam	AB2796	Clon 7A6
Bastidor magnético, imán DynaMag-15	Termo Científico	12301D	Puede ser sustituido por instrumentos similares
Kit iDeal ChIp-seq para Histones	Diagenode	C01010059
Centrífuga pequeña	Termo Científico	Fresco de Heraeus 17	Puede ser sustituido por instrumentos similares
Agitador Duomax 1030	Instrumentos Heidolph	543-32205-00	Puede ser sustituido por instrumentos similares
Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt (100X)	Termo Científico	78440
IRDye 680LT Burro anti-Conejo IgG (H + L), 0,5 mg	LI-COR Biociencias	926-68023
IRDye 800CW Cabra anti-Ratón IgG (H + L), 0,1 mg	LI-COR Biociencias	925-32210
Tubo DNA LoBind 1,5 mL	Eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
37 % Formaldehído p.a., ACS	Roth	4979.1
1 X PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 Ultrasonido focalizado	Covaris	500295
Búfer de ejecución MES SDS de 20X Bolt	Termo Científico	B0002
Solución salina tamponada Tris (TBS-10X)	Señalización celular	#12498
Dispositivo de transferencia de gel iBlot 2	Termo Científico	IB21001
iBlot 2 Pilas de Transferencia, nitrocelulosa, tamaño regular	Termo Científico	B23001
Centrífuga grande	Eppendorf	5804R	Puede ser sustituido por instrumentos similares