Cultivo y recolección de clones de HSPC: un método para obtener los clones de HSPC clasificados individualmente

Resumen

Fuente: Huber, A. R., et al. Caracterización de la carga mutacional y la composición clonal de la sangre humana. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe el protocolo para aislar HSPCs de la médula ósea y clasificarlas utilizando una técnica de clasificación de células activadas fluorescentes, que es un método para obtener HSPCs clasificadas individualmente. Cultivamos estas células clasificadas para obtener clones de HSPC.

Protocolo

1. Aislamiento, clasificación y cultivo de HSPC

1. Centrifugar a 1–2 x 10⁷ células mononucleares durante 5 min a 350 x g y resuspender en 50 μL de tampón FACS. Vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de solución de tinción anti-CD3 (dilución 1:100 del anticuerpo anti-CD en tampón FACS). Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Al clasificar con >2 x 10⁷ células, aumente la mezcla de anticuerpos y los volúmenes de tampón FACS en consecuencia.
2. Prepare 50 μL de 2 mezclas de tinción HSC de acuerdo con la receta que se ve en la Tabla 1
3. Mezcle 50 μl de solución celular con la mezcla de tinción HSC preparada e incube las células durante 15 min a temperatura ambiente (RT) o durante 1 h en hielo para que los anticuerpos se unan.
4. Lavar las células añadiendo 1 mL de tampón FACS y pellet centrifugando durante 5 min a 350 x g.
5. Vuelva a suspender las células en 300 μL de tampón FACS y filtre la suspensión celular a través de un tubo de poliestireno de 5 mL de 35 μm con tapón de filtro de células para eliminar los grupos de células antes de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
6. Prepare 25 mL de medio de cultivo HSPC, que consiste en 1x medio SFEM suplementado con 100 ng/mL de SCF, 100 ng/mL de Flt3, 50 ng/mL de TPO, 10 ng/mL de IL-3, 20 ng/mL de IL-6 y 100 ng/mL de formulación antibiótica (consulte la Tabla de materiales).
7. Llene una placa de cultivo celular de 384 pocillos con 75 μL de medio de cultivo HSPC en cada pocillo.
   NOTA: Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 μL de agua estéril o PBS, y no utilice estos pozos para la clasificación de celdas.
8. Clasificación de HSPC individuales
   1. Establezca puertas para la clasificación de HSPC en función de un control no teñido (HSC clasificadas individualmente) y 10.000 células de la muestra teñida. En la Figura 1 se muestra un resultado representativo de la configuración de puertas. Puerta de celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la fracción lineal de altura FSC frente a la fracción de área FSC. Utilice la fracción de control sin manchar para dibujar la puerta de la fracción ^de linaje. Dibuje puertas para células CD34⁺ y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para células CD38-CD45RA-.
   2. Cargue la placa de 384 pocillos en la máquina FACS y clasifique las celdas individuales.
      NOTA: Si corresponde a la máquina FACS, active la opción de mantener los datos de clasificación de índices para permitir el seguimiento de las celdas ordenadas.
9. Cultivo de HSC clasificadas individualmente
   1. Transfiera directamente la placa de 384 pocillos a una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
      nota: Para evitar la evaporación durante el cultivo, envuelva la placa de cultivo de 384 pocillos (con tapa) en una envoltura de polietileno transparente.
   2. Mantenga la placa de 384 pocillos en la incubadora durante 3-4 semanas hasta que aparezcan los clones visibles. En la Figura 2 se muestran imágenes representativas de cultivos clonales. En función de la condición del material de entrada, entre el 5% y el 30% de las células clasificadas se expandirán clonalmente.

anticuerpo	volumen [μL]
BV421-CD34	5
Mezcla FITC-Linaje (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	número arábigo
APC- CD90	0.5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
Búfer FACS	25.5

Tabla 1: Mezcla de clasificación HSC.Se muestra una tabla que indica las diluciones de los anticuerpos utilizados para clasificar las HSC.

2. Cosechando clones de HSPC

1. Después de 4 semanas de cultivo, determine qué pozos tienen una confluencia del 30% o más.
2. Rellene previamente (para cada excrecencia clonal) microtubos de 1,5 mL con 1 mL de BSA al 1% en PBS y etiquete el tubo de acuerdo con el pocillo correspondiente.
3. Humedecer previamente la punta de una pipeta con un 1 % de BSA en PBS para minimizar el número de células que se adhieren a la punta de la pipeta.
4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo el medio en el pocillo ferozmente (al menos 5 veces) con una pipeta de 200 μL (ajustada a 75 μL) y raspe el fondo del pocillo para aflojar las células en el pocillo, y recoja la suspensión celular en el microtubo marcado correspondiente al pocillo.
5. Tome 75 μL de BSA fresco al 1% en PBS y repita el pipeteo en el pocillo para garantizar la máxima absorción de células.
   NOTA: Las células cultivadas clonalmente pueden adherirse al fondo del pocillo. Inspeccione los pocillos con un microscopio de luz invertida estándar para asegurarse de que se hayan recolectado todas las células.
6. Si se han cosechado todos los pocillos con una confluencia del >30%, vuelva a colocar la placa de 384 pocillos en la incubadora. Los cultivos clonales pueden proliferar hasta 5 semanas.
7. Gire la suspensión de celdas durante 5 minutos a 350 x g. Un pequeño perdigón debe ser visible.
8. Retire con cuidado todo el sobrenadante, excepto unos 5 μL. Los gránulos celulares pueden congelarse a -20 °C y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN.

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo que representa el procedimiento experimental basado en el material de entrada. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CD11c FITC	BioLeyenda	301603	Clon 3.9
CD16 FITC	BioLeyenda	302005	Clon 3G8
CD3 BV650	BioLeyenda	300467	Clonar UCHT1
CD34 BV421	BioLeyenda	343609	561
CD38 PE	BioLeyenda	303505	Clonar HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	BioLeyenda	304121	Clonar HI100
CD49f PE/Cy7	BioLeyenda	313621	Clonar GoH3
CD90 APC	BioLeyenda	328113	Clon 5E10
Filtro de células Tubo de 5 mL	Corning	352235
Placa CELLSTAR, 384w, 130 μL, F-bottom, TC, tapa	Greiner	781182
Ligando Flt3 humano, grado premium	Miltenyi Biotech	130-096-479	Reconocimiento en alícuotas de un solo uso (25 μL) a 100 μg/mL en 0,1% BSA en PBS
IL-3 recombinante humana (expresada por E. coli)	Tecnologías de células madre	78040.1	Reconocimiento en alícuotas de un solo uso (2,5 μL) a 100 μg/mL en BSA al 0,1% en PBS
IL-6 recombinante humana (E. coliexpress)	Tecnologías de células madre	78050.1	Reconocimiento en alícuotas de un solo uso (5 μL) a 100 μg/mL en BSA al 0,1% en PBS
SCF humano, grado premium	Miltenyi Biotech	130-096-695	Reconocimiento en alícuotas de un solo uso (25 μL) a 100 μg/mL en 0,1% BSA en PBS
TPO humano, grado premium	Miltenyi Biotech	130-095-752	Reconocimiento en alícuotas de un solo uso (12,5 μL) a 100 μg/mL en 0,1% BSA en PBS
Linaje (CD3/14/19/20/56) FITC	BioLeyenda	348701	Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Hecho en las instalaciones del Instituto. También se puede utilizar PBS disponible comercialmente
Primocina	Invivogen	ant-pm-1	Formulación de antibióticos