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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
Aislamiento de células c-Kit+ de médula ósea
- Sacrificar los ratones de acuerdo con las directrices institucionales.
NOTA: Aquí, los ratones fueron expuestos a dióxido de carbono (CO2) a una tasa de flujo recomendada por la AVMA hasta que la muerte fue determinada por el cese de la respiración y los latidos del corazón, seguido de una dislocación cervical.
- Recoge los huesos de las patas del ratón: dos fémures, dos tibias y dos ilíacos. Limpie todos los tejidos de los huesos raspándolos con un bisturí. Coloque los huesos de la pierna en 1x PBS frío en hielo: 5 ml en un tubo de 15 ml. Vierta el contenido del tubo en un mortero y tritúrelo con un mortero.
- Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo con tapón de rosca de 50 mL con una pipeta de 10 mL conectada, usando una pipeta. Lave el mortero varias veces con PBS frío 1x, recogiendo y añadiendo la suspensión celular al tubo de 50 mL. Centrifugar la médula ósea a 1.200 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante a través de una aspiradora con una pipeta de vidrio conectada. Suspenda el pellet de celda en 5 mL de 1x PBS con una pipeta.
- Con una pipeta, agregue lentamente médula ósea en suspensión a la parte superior de 5 mL de polisacarosa a temperatura ambiente (la temperatura es crítica), teniendo mucho cuidado de no alterar la interfaz. Centrifugar a 400 x g a temperatura ambiente durante 20 min con el freno apagado.
- Recoja la interfaz de celda mononuclear total (TMNC) turbia con una pipeta y colóquela en un nuevo tubo de 15 mL. Aumente el volumen a 10 ml con 1x PBS para el lavado, tomando 20 μL para contar, y centrifugue a 1.200 x g a 4 °C durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet en hielo para el paso 4.6.1.
- Realice el aislamiento de celdas c-Kit+.
- Siga un protocolo de kit de microperlas para el aislamiento de celdas c-Kit+. Vuelva a suspender el pellet de celda en 80 μL de 1x PBS + EDTA + BSA a 107 celdas. A la suspensión celular, agregue 20 μL de CD117 MicroBeads/107 células totales. Mezclar bien mediante vórtice e incubar durante 10 min a 4 °C. Aumentar el volumen a 10 mL añadiendo 1x PBS + EDTA + BSA y centrifugar a 1.200 x g a 4 °C durante 5 min.
- Retire el sobrenadante mediante un vacío y suspenda el pellet de celda en 500 μL / 108 celdas en total en 1x PBS + EDTA + BSA. Usando el soporte magnético con la columna magnética conectada, agregue 3 mL de 1x PBS + EDTA + BSA y deje que fluya por gravedad hacia un tubo de recolección de 15 mL.
- Una vez que la primera adición de tampón haya terminado de pasar a través de la columna, agregue la suspensión de celdas a la columna, permitiendo que fluya a través de la gravedad hacia el tubo de recolección de 15 mL. Este flujo es la fracción de celda no deseada.
- Lave la columna 3 veces con 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA cada vez, permitiendo que fluya por gravedad hacia el tubo de recolección. Retire la columna del imán y colóquela en la parte superior de un tubo de 15 ml.
- Agregue 5 mL de 1x PBS + EDTA + BSA y enjuague inmediatamente con el émbolo provisto con la columna. Retire el émbolo y repita la descarga con 5 mL adicionales de 1x PBS + EDTA + BSA. Cuente las celdas en el volumen total utilizando métodos estándar.
- Centrifugar las celdas a 1.200 x g a 4 °C durante 5 min. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en IMDM completo (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + ligando FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) para cultivo. Cultive estas células durante la noche en 2 x 106 células/1 mL de medio completo IMDM celular colocándolas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.