Transducción mediada por retrovirales: un método para introducir un gen diana en las células cancerosas

Resumen

Fuente: Kesarwani, M., et al. Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en la dependencia de oncogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe el protocolo para la validación genética mediante la transferencia de genes objetivo utilizando retrovirus en líneas celulares de leucemia mieloide crónica. Los retrovirus actúan como mediadores para transferir material genético a la célula leucémica a través del proceso llamado transducción, que permite la expresión a largo plazo del gen diana. Este método se puede aplicar a cualquier célula diana para su validación genética y desarrollo terapéutico.

Protocolo

1. Transducción

1. Transfección de plásmidos retrovirales
   1. Descongele las células HEK293 la tarde anterior en un baño de agua a 37 °C. Gire el tubo criogénico que contiene las células HEK a 435 x g a temperatura ambiente durante 3 min. Retire el sobrenadante mediante una aspiradora y suspenda el pellet de células en 1 ml de DMEM suplementado con FBS al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina.
   2. Cuente las celdas y agregue el volumen apropiado a un plato tratado de 10 cm (~4 x 10^{6 HEK293T} celdas). Agregue 14 mL del medio DMEM 10 al plato y mezcle bien deslizándolo hacia arriba y hacia abajo para una distribución uniforme. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2 durante la noche.
   3. A la mañana siguiente, verifique la confluencia de las células bajo un microscopio de luz invertida (50% o más funciona bien).
   4. Combine el ADN (plásmido retroviral deseado), PclEco (plásmido de empaquetamiento), 2 M CaCl₂ y H₂0 en un tubo de 1,5 mL (= 500 μL) utilizando una micropipeta en las siguientes cantidades: 7,5 μg de ADN (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg de pCLeco, 62 μL de 2 M de CaCl₂ y agua hasta un volumen final de 500 μL. Añada 500 μL de 2x HBS a otro tubo de 1,5 mL.
   5. Agregue la mezcla de ADN gota a gota al tubo de 1,5 mL que contiene 500 μL de HBS 2x (280 mM de NaCl, 100 mM de HEPES y 1,5 mM de Na₂HPO₄) mientras mezcla. Logre esto configurando un vórtice a la velocidad más baja y sostenga el tubo HBS sobre él para una mezcla constante mientras agrega la mezcla de transfección.
   6. Deje que la mezcla de transfección se incube durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, agregue 25 nM de cloroquina a las células HEK y vuelva a colocarlas en la incubadora. Después de la incubación, agregue la mezcla de transfección gota a gota a las celdas HEK y, luego, agite suavemente el medio para mezclar la mezcla de transfección en toda la placa.
   7. Incubar las células con la mezcla durante ~8 h en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂. Cambie el medio en estas celdas agregando muy lentamente 14 mL de medio DMEM 10 nuevo. El pipeteo lento contra la pared de la placa ayuda a evitar la extracción de las células HEK. Incubar las células durante la noche en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
   8. Recoja el sobrenadante viral con una jeringa de 10 ml, extraiga el sobrenadante en la jeringa y coloque el filtro de jeringa de 0,45 μm. Sumerge el sobrenadante viral en un nuevo tubo de recolección. Tome la primera recolección de sobrenadante viral ~ 16 h después.
2. Concentración y transducción viral de fibronectina
   1. Añada 2 mL de un fragmento de fibronectina humana recombinante de 0,1 mg en 1x PBS a placas de cultivo de 6 pocillos sin tratar. Prepare la cantidad de fibronectina que sea necesaria, lo que depende del número de células y genotipos. Un pocillo puede transducir suficientemente 10 millones de células c-Kit+. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
   2. Al día siguiente, retire la fibronectina de los pocillos con una pipeta, pipetee 2 mL de BSA estéril al 2% en 1x PBS para bloquear la placa e incube durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el BSA a través de una aspiradora y lávelo a fondo pipeteando 2 mL de 1x PBS, luego retírelo con una aspiradora.
   3. Añadir inmediatamente sobrenadante viral recién recogido y filtrado (a 0,45 μm) hasta 5 mL. Centrífuga a 435 x g a 32 °C durante 2 h. Retire el sobrenadante a través de una aspiradora y repita este paso con sobrenadante viral adicional recién recolectado y vuelva a centrifugar. Retire el sobrenadante a través de una aspiradora y lave los pocillos agregando 2 mL de 1x PBS; Luego, retíralo a través de una aspiradora.
   4. Agregue las células de ratón c-Kit + que se cultivaron durante la noche girando las células y resuspendiendo el pellet en IMDM completo, para el cultivo. Cultive estas células durante la noche en 2 x 10⁶ células/1 mL de medio completo IMDM celular colocándolas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂) en los pocillos recubiertos de virus mezclando bien las suspensiones celulares y pipeteándolas en la placa de fibronectina concentrada ahora viral. Centrifugar a 1.200 x g a 25 °C durante 90 min. Coloque las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
   5. 48 h después de la transducción, granular las células por centrifugación a 1.200 x g a 4 °C durante 5 min y resuspenderlas en tampón FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) a 6 x 10⁶/mL. Determine el porcentaje de células positivas para BCR-ABL1 midiendo el porcentaje de células positivas para YFP mediante citometría de flujo.
   6. Adquisición de eventos con el procedimiento estándar. Primero, bloquee las celdas vivas en función de la dispersión frontal y lateral. A continuación, se controlan las células vivas positivas para YFP, excluyendo las células negativas para YFP determinadas por control negativo (Figura 1).

Resultados

Figura 1: FACS que muestra la frecuencia de células YFP+ de la sangre de un ratón trasplantado y un ratón WT (control negativo). Los paneles superiores muestran un diagrama de dispersión de las celdas y la compuerta. Los paneles inferiores muestran histogramas de YFP frente a la dispersión lateral. Las células con un MFI de >10³ se cons...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
RetroNectin Fragmento de fibronectina humana recombinante	Takara	T100B
FBS	Biológico de Atlanta	S11150
Penn/Estreptococo	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutamina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL de caldo en agua
HEPES	sigma	H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	sigma	S9390
Cloruro de calcio	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambiente	AM9261
Bsa	sigma	A7906
Ensayo celular iniciador de cultivo a largo plazo en humanos	Tecnologías de células Stemp
Contador de células automatizado TC-10	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Hecho en casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Hecho en casa
ROSACreERT2	Laboratorio Jackson
C57Bl/6	Laboratorio Jackson
CML-CD34+ y células CD34+ normales	Hospital Universitario, Universidad de Cincinnati
LSR II (analizador FACS)	Bd
Fortessa I (analizador FACS)	Bd
FACSAriaII (Clasificador FACS)	Bd
Incubadora de CO2 NAPCO serie 8000 WJ	Termo científico
Rotor de cuchara oscilante cetrífugo 5810R	Eppendorf
Jeringa de insulina Lo-Dose u-100 de 1/2 cc 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Hemisuccinato de sodio de hidrocortisona	Tecnologías de células madre	7904
GM-CSF	Especificaciones	CYT-221
G-SCF	Especificaciones	CYT-220
IL-3 humana	Especificaciones	CYT-210
SCF humano	Especificaciones	CYT-255
Eritropoyeína	Amgen	5513-267-10
BD Perm/Wash (permeabilización y solución de lavado para el flujo de fosfo)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Solución de fijación y permeabilización)	Bd	554714
BD Pharm Lyse	Bd	555899
70 μm de nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
Filtro de disco acrobático de 0,45 μM	Pall	2016-10