Ensayo de UFC basado en metilcelulosa: un método para determinar el efecto de los compuestos anticancerígenos en la formación de colonias en células leucémicas

Resumen

Fuente: Kesarwani, M., et al. Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en la dependencia de oncogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe el protocolo para el ensayo de unidad de formación de colonias basado en metilcelulosa o UFC, que ayuda a identificar y contar el número de colonias formadas por células leucémicas en respuesta al tratamiento con compuestos anticancerígenos.

Protocolo

1. Ensayos de unidades formadoras de colonias

1. Descongele la metilcelulosa con citocinas para ratones a temperatura ambiente durante 1-2 h. Alícuota 3 mL de metilcelulosa en un tubo FACS usando una jeringa de 5 mL sin aguja. Ordene las celdas positivas para YFP en un clasificador de células.
2. Gire las celdas hacia abajo y suspenda el pellet en medios completos IMDM. Cuente las células que se van a sembrar y dilúyalas para obtener 5.000 células YFP positivas en 100 μL de medio completo IMDM.
3. Añadir 100 μL de la suspensión celular que contiene 5.000 células YFP-positivas y los inhibidores apropiados a 3 mL de metilcelulosa. Vórtice en lo alto para mezclarlo durante 10-30 s.
4. Después de que la mayoría de las burbujas de aire se hayan escapado, use una jeringa de 1 mL para colocar 1 mL de medio en tres placas de 3 cm replicadas expulsando el medio por un lado e inclinando lentamente la placa con un movimiento circular para extenderla uniformemente.
5. La concentración final de los inhibidores a utilizar es imatinib a 3 μM, DFC a 0,2 μM y BCI a 0,5 μM, solos o en combinaciones. Cuando proceda, suprimir el c-Fos colocando las células en placas con 4-hidroxitamoxifeno (1 μg/mL) añadido a la metilcelulosa.
6. Después de emplatar, coloque las placas en una placa de Petri grande con una placa abierta que contenga 2 ml de agua estéril en el medio. Cubra la placa de Petri grande e incube cuidadosamente a 37 °C, incubadora con 5% de CO₂. Registre el número de colonias después de una semana de siembra contando el número total de colonias bajo un microscopio.
7. Analice algunas colonias de placas apropiadas para la deleción de c-Fos por PCR. Recoge las colonias chupándolas con una punta P1000. Desaloje las células en 500 μL de 1x PBS lavando la punta en el PBS varias veces. Centrifugar las suspensiones celulares a 6.000 x g durante 1 minuto y extraer el ADN de la célula utilizando un kit de aislamiento de ADN genómico.
8. Utilice el ADN genómico para la PCR utilizando los cebadores mFos-FP3 y mFos-RP5. Analice los productos de PCR en un gel de agarosa al 2% y una imagen utilizando un sistema de documentación de gel.
9. Para una presentación gráfica de las colonias, tiña las colonias con cloruro de yodonitrotetrazolio. Disuelva 10 mg de cloruro de yodonitrotetrazolio en 10 mL de agua para obtener una solución de 1 mg/mL. Filtro: esterilice la solución utilizando un cierre Luer con un filtro de 0,2 μm conectado a una jeringa de 10 mL en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
10. En la campana de cultivo de tejidos, agregue 100 μL de solución de tinción gota a gota alrededor de la placa CFU; tenga cuidado de no deslizar ni alterar las colonias. Incubar las placas durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO₂. Las colonias se volverán de color marrón rojizo oscuro. Usando un fondo blanco en la cubierta de cultivo de tejidos estériles, tome fotos de la placa de UFC teñida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (Metilcelulosa para UFC de ratón)	célula madre	3434
4-Hidroxitamoxifeno	sigma	H6278
SCF murino recombinante	Especificaciones	CYT-275
ligando flt3 murino recombinante	Especificaciones	CYT-340
IL-6 murina recombinante	Especificaciones	CYT-350
IL-7 murina recombinante	Peprotech	Artículo 217-17
Dfc	Laboratorios LKT Inc.	D3420
BCI (en inglés)	Chemzon Científico	NZ-06-195
Imatinib	Laborator de LC	I-5508
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
Jeringa de insulina Lo-Dose u-100 de 1/2 cc 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Cloruro de yodonitrotetrazolio	sigma	I10406
Instrumentos
Incubadora de CO2 NAPCO serie 8000 WJ	Termo científico
Rotor de cuchara oscilante cetrífugo 5810R	Eppendorf
C-1000 Termociclador	Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (sistema de imágenes para geles y Western blots)	Bio-RAD	17001401
ratón
ROSACreERT2	Laboratorio Jackson
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Hecho en casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Hecho en casa