Selección inmunomagnética negativa: un método para purificar células B a partir de células mononucleares de sangre periférica

Resumen

Fuente: Serra S. et al. Ensayo basado en HPLC para monitorear el metabolismo extracelular de nucleótidos/nucleósidos en células humanas de leucemia linfocítica crónica. J. Vis. Exp. (2016)

El video explica una forma de purificar las células B mediante la orientación inmunomagnética y la separación de la suspensión de células mononucleares de sangre periférica. El método consiste en etiquetar tipos de células no deseadas con anticuerpos o ligandos específicos (unidos a partículas magnéticas) dirigidos a proteínas específicas de la superficie celular, para ser agotadas de la suspensión celular heterogénea por separación magnética.

Protocolo

1. Purificación de células B leucémicas mediante aislamiento negativo

1. Resuspender 10⁷ PBMCs/ml en PBS 0,1 % albúmina sérica bovina (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (tampón de aislamiento).
2. Añadir 10 μg de anticuerpos primarios monoclonales anti-CD3, -CD14 y -CD16 de ratón para 10^{a 7} células e incubar durante 30 min a 4 °C.
3. Lavar las células con el tampón de aislamiento y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
4. Vuelva a suspender las células en el tampón de aislamiento a 10⁷ PBMC/ml.
5. Antes de incubar con las células, vuelva a suspender las perlas magnéticas de IgG anti-ratón de oveja en el vial. Transfiera 100 μl de perlas por cada 10⁷ células a un tubo.
6. Añadir 1 mL de tampón de aislamiento y colocar el tubo en un soporte magnético durante 1 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 5 ml.
7. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas lavadas en 100 μl de tampón aislante.
8. Incubar 10⁷ celdas con 100 μl de perlas magnéticas durante 30 min a 4 °C con inclinación y rotación suaves.
9. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 2 minutos y transfiera el sobrenadante con las células no unidas CD19⁺/CD5⁺ a un tubo nuevo con una pipeta de 5 ml.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sangre humana
anti-CD3 purificado, -CD14, -CD16	Hecho en casa		monoclonal de ratón
Dynabeads ovejas anti-ratón IgG	Invitrogen	11031
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Amresco	E404-200PESTAÑAS	Tabletas
albúmina sérica bovina (BSA)	Biografía de ID	1000-70	Grado estándar
Búfer de aislamiento			PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
Imán DynaMag-15	Invitrogen	12301D	Separador de cordones magnético Dynal