Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Resumen

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Resumen

Pez cebra es un modelo animal popular para la investigación sobre el desarrollo del ojo, debido a su rápida

Protocolo

Parte 1: Preparativos antes de microdisección

1. Soluciones
   1. E3 medio ⁴ (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂ y 0,33 mM MgSO _4).
   2. Solución de Ringer ^{1, 5} (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7.2), esterilizado por filtración.
   3. NaOH 5N.
2. Ataque químico de las agujas de tungsteno
   1. Asegurar un pequeño vaso que contiene NaOH 5 N en una placa de Petri de arcilla.
   2. Adjuntar un clip de papel en el lado del vaso, por lo que entra en contacto con la solución de NaOH.
   3. Conecte el electrodo negat....

Discusión

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra puede efectivamente obtener la retina intacta y las retinas de RPE-adjunto. Esto ayuda considerablemente los estudios de expresión pertenecientes a un tejido ocular específico (es decir, la retina o RPE). De hecho, hemos utilizado con éxito estos procedimientos para obtener los perfiles de expresión de ARN de toda la retina y el EPR ^{1 3.} La utilidad de estos perfiles es apoyado fuertemente por nuestra reciente identificación de las vías y las familias de gene.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Motor de pistilo inalámbrico	VWR international	47747-370
Fuente de alimentación de corriente continua	Lascar	PSU130	Cualquier fuente de alimentación de corriente continua funcionará. El voltaje específico de una máquina diferente requerirá una optimización adicional.
Pestillo desechable &y microtubo, 1,5 mL (libre de DNasa, RNasa y pirogénos)	VWR international	47747-366	Estos se utilizan para la recolección de tejidos en TRIzol para análisis de expresión.
Pinzas Dumont #5, puntas: 0,05 x 0,01 mm, acero inoxidable	World Precision Instruments, Inc.	500341	La dimensión de la punta fina es deseable pero no inflexible, ya que puede ser necesario afilar la punta de vez en cuando.
Pinzas Dumont #5SF, puntas: 0,025 x 0,005 mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	La dimensión de la punta fina es deseable pero no inflexible, ya que puede ser necesario afilar la punta de vez en cuando.
Placas de cultivo de poliestireno Falcon, 60 x 15 mm	BD Biosciences	351007	Estas placas se utilizan como placas de disección.
Olympus SZX16 Microscopio estereoscópico	Olympus Corporation	SZX16	Cualquier estereomicroscopio funcionaría. En estudios previos utilizamos un estereomicroscopio Leica.1-3 sin ningún problema. También utilizamos exclusivamente el objetivo de 1X para la disección, aunque tenemos instalado un objetivo de 2X.
Piedra de afilar	Fine Science Tools	29008-01	Úsese para afilar la punta de la pinza si es necesario
placa térmica	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	Esto se utiliza para mantener la temperatura del tejido durante la disección y minimizar la influencia de las fluctuaciones térmicas sobre la expresión génica. También colocamos todo el microscopio en una habitación con condiciones ambientales controladas a 28°C durante la disección en estudios previos1-3 con buenos resultados.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
alambre de tungsteno, diámetro de 0,015 pulgadas	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Aplicador de madera	Puritano	807	Esto se utiliza para sostener la aguja de tungsteno grabada químicamente.