Aislamiento de células T-ALL marcadas con fluorescencia: un método para aislar células T-ALL de pez cebra adulto

Resumen

Fuente: Pruitt, M. M., et al. Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda de células T inducida por Myc en pez cebra. J. Vis. Exp. (2017).

Este protocolo describe la técnica de aislar células tumorales de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) marcadas con fluorescencia de un pez cebra adulto y cuantificarlas utilizando un colorante azul de tripano.

Protocolo

1. Colección de células T-ALL marcadas con fluorescencia del pez tumoral primario

1. Prepare al menos 20 mL de suero fetal bovino inactivado por calor al 10% en solución salina tamponada con fosfato 0,9x (FBS/PBS).
2. Añadir 1 mL de FBS/PBS a un vial de sal sódica de heparina (300 unidades).
3. Seleccione peces que tengan tumores en más del 50% del cuerpo, o aquellos peces que tengan dificultades para comer o nadar. Sacrifique los peces mediante una sobredosis de tricaína o mediante inmersión en agua helada. Confirmar la muerte por falta de movimiento branquial y latidos cardíacos.
4. Usa una cuchilla de afeitar para quitar la cabeza del pez.
5. Lave la cavidad del pez con la solución de heparina para eliminar el exceso de glóbulos rojos.
   1. Con una pipeta, inyecte 100 μL de solución de heparina (Agregue 1 mL de FBS/PBS a un vial de sal sódica de heparina) en la cavidad corporal del pez. Retire todo el líquido que se derrame (contendrá células sanguíneas) y pipetee en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Utilice una punta de pipeta nueva para volver a lavar el cuerpo. Realice al menos tres lavados, o hasta que el líquido que se derrama parezca libre de sangre.
   3. Deseche todo el líquido de los lavados en estos pasos, ya que no se utilizará en análisis posteriores.
6. Recolecta las células leucémicas.
   1. Inyecte 100 μL de FBS/PBS en la cavidad corporal del pez.
   2. Aplique una presión suave en el exterior del cuerpo del pez con la punta de la pipeta para exprimir/expulsar las células tumorales.
      nota: Si este paso se realiza con un microscopio de disección, las células tumorales que se derraman fuera de la cavidad corporal serán evidentes.
   3. Recoja el líquido y las células de cada lavado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   4. Repita los pasos 1.6.1-1.6.3 hasta que se recolecten la mayoría de las células tumorales (generalmente de 5 a 10 veces). Recoja todas las células tumorales en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga las celdas a temperatura ambiente.
7. Mezcle las células tumorales recolectadas del paso anterior pipeteándolas suavemente para disociar los grupos de células. Filtre la suspensión celular a través de un filtro de malla de 40 μm. Lave el filtro 1-2 veces con 100 μL de FBS/PBS. Mantenga las celdas a temperatura ambiente.
8. Mezclar 2 μL de suspensión celular con 18 μL de azul de tripano (0,4%, diluido 1:10 y filtrado) en un tubo nuevo. Cargue 10 μL en un hemocitómetro y cuente el número de células fluorescentes vivas (no azules) para calcular el número de células tumorales aisladas.
   nota: Es probable que las células no azules GFP negativas sean células T normales, no malignas, y no se deben contar. Se requieren al menos 2 x 10⁶ células para teñir las células con Hoechst 33342.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pez cebra singénico (CG2)			Véase Mizgireuv et al., 2006
rag2: plásmido c-myc			Laboratorio Langenau
rag2:Plásmido GFP construido en de Jong Lab			Promotor rag2 del Laboratorio Langenau
plásmido pCS2-transposasa			Laboratorio Chien
Microscopio SteREO Discovery V8	Microscopía Carl Zeiss	495015-0008-000
Metanosulfonato de tricaína (MS-222)	Química Occidental, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
Suero fetal bovino (FBS)	Laboratorios HyClone, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco por Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Sal sódica de heparina	Sigma-Aldrich	Año 2106	15 - 300 viales unitarios
Filtro de malla de 40 μm	Marca Falcon Corning	352340	Caso de 50
Azul de tripano	Sigma Ciencias de la Vida	T8154	20 mL - Solución (0,4%)