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1. Tinción de las células T-ALL marcadas con fluorescencia con Hoechst 33342 para identificar la población lateral
- Diluya Hoechst 33342 1:10 con H2O sin nucleasas para obtener la concentración de trabajo de 1 mg/mL. Almacene el tinte a 4 °C y en la oscuridad.
- Prepare una solución de 100 mM de verapamilo disolviendo 49,1 mg en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
nota: El verapamilo es un inhibidor de los transportadores ABC y es un control importante para los experimentos de población secundaria. La adición de verapamilo a las muestras inhibirá la capacidad de los transportadores ABC para expulsar el colorante Hoechst 33342. Por lo tanto, una población lateral verdadera desaparecerá cuando se agregue verapamilo a la muestra.
- Pon un baño maría a 28 °C.
- Prepare muestras y controles en la oscuridad agregando celdas y soluciones a los tubos clasificadores de células activadas por fluorescencia (FACS).
- Prepare las muestras añadiendo 106 células, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 y 2,5 μL de DMSO a un tubo FACS. Ajuste el volumen a 1 mL con FBS/PBS.
- Prepare los controles añadiendo 106 células, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 y 2,5 μL de 100 mM de verapamilo a un tubo FACS. Ajuste el volumen a 1 mL con FBS/PBS.
nota: Se recomienda un mínimo de 10a 6 células/muestra, pero es preferible teñir más células, especialmente si las células de la población lateral se van a clasificar para un análisis posterior. No supere las 106 células/ml y mantenga la concentración de Hoechst 33342 en 15 μg/ml. Si se tiñen10 x 10 6 células, el volumen total de reacción es de 10 ml.
- Incubar en un baño de agua a 28 °C en la oscuridad durante 120 min.
- Después de la incubación, coloque las células inmediatamente en hielo y manténgalas en la oscuridad.
- Granular las células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Lavar con 1 mL de FBS/PBS.
- Granular las células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de FBS/PBS.
- Mantener a 4 °C hasta la clasificación de las células.
- 15 minutos antes de la clasificación de células, añadir 2 μL de caldo de yoduro de propidio (PI) (1 mg/mL) a cada 1 mL de FBS/PBS (concentración final: 2 μg/mL). Mezclar bien.
2. Utilice FACS para encontrar la población lateral dentro de la población de células T-ALL marcadas con fluorescencia
- Analice las suspensiones celulares T-ALL de pez cebra teñidas en un clasificador de células equipado con un láser UV para la excitación del colorante Hoechst 33342 y un láser de 488 nm para la excitación PI y para la detección de las células GFP+ T-ALL.