Ensayo de población lateral: un método para aislar la población lateral de células tumorales del pez cebra

Resumen

Fuente: Pruitt, M. M., et al. Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda de células T inducida por Myc en pez cebra. J. Vis. Exp. (2017).

El siguiente protocolo describe un método para aislar la población lateral de células tumorales de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), que consiste en células madre, de un pez cebra adulto. La población lateral carece de marcadores celulares prominentes y, por lo tanto, utilizamos el ensayo de eflujo de colorante Hoechst 33342 para aislarlos.

Protocolo

1. Tinción de las células T-ALL marcadas con fluorescencia con Hoechst 33342 para identificar la población lateral

1. Diluya Hoechst 33342 1:10 con H₂O sin nucleasas para obtener la concentración de trabajo de 1 mg/mL. Almacene el tinte a 4 °C y en la oscuridad.
2. Prepare una solución de 100 mM de verapamilo disolviendo 49,1 mg en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
   nota: El verapamilo es un inhibidor de los transportadores ABC y es un control importante para los experimentos de población secundaria. La adición de verapamilo a las muestras inhibirá la capacidad de los transportadores ABC para expulsar el colorante Hoechst 33342. Por lo tanto, una población lateral verdadera desaparecerá cuando se agregue verapamilo a la muestra.
3. Pon un baño maría a 28 °C.
4. Prepare muestras y controles en la oscuridad agregando celdas y soluciones a los tubos clasificadores de células activadas por fluorescencia (FACS).
   1. Prepare las muestras añadiendo 10⁶ células, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 y 2,5 μL de DMSO a un tubo FACS. Ajuste el volumen a 1 mL con FBS/PBS.
   2. Prepare los controles añadiendo 10⁶ células, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 y 2,5 μL de 100 mM de verapamilo a un tubo FACS. Ajuste el volumen a 1 mL con FBS/PBS.
      nota: Se recomienda un mínimo de 10^{a 6} células/muestra, pero es preferible teñir más células, especialmente si las células de la población lateral se van a clasificar para un análisis posterior. No supere las 10⁶ células/ml y mantenga la concentración de Hoechst 33342 en 15 μg/ml. Si se tiñen¹⁰ x 10 6 células, el volumen total de reacción es de 10 ml.
5. Incubar en un baño de agua a 28 °C en la oscuridad durante 120 min.
6. Después de la incubación, coloque las células inmediatamente en hielo y manténgalas en la oscuridad.
7. Granular las células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Lavar con 1 mL de FBS/PBS.
8. Granular las células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de FBS/PBS.
9. Mantener a 4 °C hasta la clasificación de las células.
10. 15 minutos antes de la clasificación de células, añadir 2 μL de caldo de yoduro de propidio (PI) (1 mg/mL) a cada 1 mL de FBS/PBS (concentración final: 2 μg/mL). Mezclar bien.

2. Utilice FACS para encontrar la población lateral dentro de la población de células T-ALL marcadas con fluorescencia

1. Analice las suspensiones celulares T-ALL de pez cebra teñidas en un clasificador de células equipado con un láser UV para la excitación del colorante Hoechst 33342 y un láser de 488 nm para la excitación PI y para la detección de las células GFP+ T-ALL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino (FBS)	Laboratorios HyClone, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco por Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Hoechst 33342	Tecnologías de la Vida	H3570	10 mL
Verapamilo	Sigma Ciencias de la Vida	V4629	1 g
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Ciencias de la Vida	D8418	100 mL
Yoduro de propidio	Tecnologías de la Vida	P3566	10 mL
Clasificador de células FACSAria Fusion	BD Biociencias