Implantación guiada por ultrasonido: una técnica para implantar células de adenocarcinoma ductal pancreático en un ratón adulto

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de Jove.

1. Preparación prequirúrgica de ratones

NOTA: Se recomienda realizar este paso 24 horas antes del procedimiento.

1. Coloque las jaulas que contengan ratones experimentales en un calentador ajustado a 37 ° C.
2. Obtenga jaulas nuevas y limpias y colóquelas en una segunda plataforma de calentamiento ajustada a 37 ° C.
3. Limpie a fondo la cabina de seguridad biológica, la cámara de inducción y la etapa de ultrasonido (US) con esterilizante (ver Tabla de Materiales).
4. Gire la función de calentamiento del escenario de EE. UU. a 37 ° C.
5. Encienda la máquina de anestesia: ajuste los diales del divisor de tubos para que el flujo de aire se restrinja solo a la cámara de inducción. Encienda el tanque de oxígeno y ajuste el caudal a 1 L/min. Encienda el vaporizador de isoflurano al 2-3%.
6. Coloque un solo ratón en la cámara de inducción. Monitoree el mouse hasta que ya no sea móvil y la respiración se haya ralentizado.
7. Ajuste los diales del divisor para que se permita el flujo de aire tanto a la cámara de inducción como al cono de la nariz. Mueva rápidamente el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en decúbito ventral en el cálido escenario de EE. UU. con su hocico en el cono de la nariz.
8. Pruebe el nivel de inducción observando cualquier respuesta refleja al pellizco de los dedos de los pies. Si no hay ninguno, el mouse está listo para la depilación.
9. Coloque una pequeña cantidad de lubricante ocular (consulte la Tabla de materiales) en ambos ojos para prevenir la deshidratación de los tejidos. Gire el ratón para que quede en decúbito dorsal sobre el escenario. Adherir suavemente las extremidades superiores e inferiores a la platina con cinta de papel para maximizar la exposición del abdomen y asegurar el ratón a la platina.
10. Use un aplicador estéril de punta de algodón para aplicar una crema depilatoria de capa generosa en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. El depilatorio debe aplicarse en el área general del bazo y extenderse hacia la línea media. Deje reposar durante aproximadamente un minuto.
11. Pruebe el grado de depilación utilizando suavemente el extremo opuesto del aplicador de punta de algodón para limpiar la crema depilatoria, una vez que se retire fácilmente, limpie el abdomen con una gasa seca. A continuación, humedece una capa limpia de gasa con una pequeña cantidad de solución salina tibia y vuelve a limpiar la zona para eliminar por completo el agente depilatorio. No exceda los 2 minutos completos de contacto directo con la piel del ratón para reducir la posibilidad de quemaduras químicas.
12. Una vez que el pelo se haya eliminado lo suficiente del abdomen, regrese al ratón a una nueva jaula limpia en un calentador.
13. Mientras que el primer animal se somete a la depilación en la etapa de EE. UU., el siguiente animal se puede agregar a la cámara de inducción.
14. Antes de anestesiar la siguiente jaula de ratones, apague el isoflurano y enjuague la cámara de inducción con oxígeno. Limpie la cámara de inducción y el cono de la etapa/nariz de EE. UU. con esterilizante. Repita los pasos 1.5-1.14 hasta que todas las jaulas y ratones se hayan sometido a la depilación.
    nota: Se puede considerar la retirada temporal de alimentos en animales mediante la retirada temporal de alimentos durante un período antes de la implantación para minimizar la obstrucción visual de los órganos abdominales debido a los alimentos no digeridos en el estómago y los intestinos (12-24 horas). No se recomienda la restricción de agua. Si los animales están en ayunas, se recomienda que se traten con una inyección de 1 ml de solución salina estéril tibia (37 °C) después de la inyección tumoral para prevenir la deshidratación.

>2. Implantación guiada por ultrasonido de células PDA

NOTA: Todos los procedimientos de ultrasonido se realizan utilizando una máquina y software de imágenes de ultrasonido (ver Tabla de Materiales). El transductor tiene una frecuencia central de 40 MHz y un ancho de banda de 22-55 MHz.

1. Ajuste la plataforma de ultrasonido de manera que la superficie de la plataforma sea paralela al suelo y el investigador mire hacia el lado izquierdo del animal, con la cabeza del animal hacia la derecha. Ajuste la posición del transductor para obtener una imagen abdominal transversal (Figura 1A).
2. Anestesiar el ratón que se va a inyectar como se describe en los pasos 1.1-1.8. Estabilice el mouse en la plataforma de EE. UU. como se describe en el paso 1.9.
3. Aplique una cantidad generosa de gel de ultrasonido tibio (37 °C) en la sección sin vello del abdomen.
4. Baje suavemente el transductor para que entre en contacto con el abdomen del ratón. Ajuste el transductor según sea necesario hasta que el páncreas sea claramente visible. Localice el riñón izquierdo y el bazo para proporcionar una orientación precisa de la cavidad abdominal.
   nota: Debido a que la posición del transductor se ha cambiado para permitir el acceso al lado izquierdo del abdomen, los ejes X e Y en los controles de la platina ahora están invertidos.
5. Cargue una jeringa de insulina de 29 G x 1/2" (consulte la tabla de materiales) con 25 μl de suspensión de células tumorales. Limpie la punta de la aguja con una almohadilla de preparación con alcohol estéril antes de la inyección para minimizar la siembra de células tumorales en la pared abdominal.
6. Con pinzas de borde romo, agarre la piel y la pared peritoneal para aumentar la tensión en el lugar de inyección deseado. Sosteniendo la jeringa en un ángulo aproximado de 25°-45° con respecto a la superficie de la plataforma de ultrasonido, avance lentamente la aguja a través de la piel y la pared peritoneal. Confirme que la aguja ha perforado la pared peritoneal antes de continuar con el siguiente paso. Se debe sentir un pequeño chasquido cuando la aguja perfora la pared peritoneal.
7. Bajo la visualización de ultrasonido, guíe la aguja directamente hacia el páncreas (Figura 1B-C). Confirme que la aguja está dentro del tejido del páncreas moviendo suavemente el cilindro de la jeringa hacia arriba y hacia abajo. Si la colocación es correcta, la punta de la aguja permanecerá dentro del tejido pancreático mientras el cilindro de la jeringa se mueve.
8. Inyecte lentamente las células tumorales y confirme que las células se están implantando en el lugar deseado mediante la formación de un bolo de líquido dentro del páncreas (visible en la pantalla de ultrasonido, Figura 1D).
   nota: Se debe sentir cierta resistencia al presionar el émbolo. Tenga cuidado de no perforar el páncreas varias veces, ya que esto aumenta la probabilidad de fugas a la cavidad abdominal.
9. Una vez que se haya inyectado todo el volumen de suspensión y se pueda ver un bolo de líquido en el páncreas, mantenga la aguja muy quieta durante varios segundos. Retraiga lentamente la aguja del abdomen del ratón, teniendo mucho cuidado de no perturbar las células inyectadas.
10. Coloque al ratón en una jaula limpia y cálida y asegúrese de que el ratón se recupere completamente de la anestesia. Repita este proceso para todos los animales.
11. Antes de anestesiar al siguiente ratón, limpie la cámara de inducción y el cono de la etapa o nariz de EE. UU. con esterilizante.
12. Repita los pasos 2.2-2.11 hasta que se hayan inyectado todos los ratones.

Figura 1: Implantación guiada por ultrasonido de células PDA en el páncreas murino. (A) Orientación del ratón, etapa de ultrasonido y sonda de ultrasonido utilizada para obtener una imagen de alta resolución de los órganos abdominales. Tenga en cuenta que la platina y la plataforma se han girado 90° con respecto a la orientación estándar para permitir un fácil acceso al cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón. (B) Imagen ultrasonográfica que representa la identificación de riñón, bazo y páncreas. Aquí, la aguja de inyección se coloca contra el abdomen del ratón. (C) Imagen ultrasonográfica que muestra la aguja dentro del páncreas del ratón. (D) Imagen ultrasonográfica que muestra la burbuja en el lugar de la inyección (delineada en azul) después de la inyección controlada de células tumorales en el páncreas. (E) Laparotomía que revela el bolo de líquido que contiene células PDA en el páncreas después de la inyección guiada por ultrasonido. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.