1. Aislamiento de neuronas
Una vez finalizada la recolección del extracto/sobrenadante, continúe con el aislamiento de las neuronas.
- En el caso de las neuronas DRG, se recoge la DRG cervical a lumbar de ratas recién nacidas entre el día postnatal (P) 2-12 después de la decapitación y la disección estereomicroscópica de la DRG (Figura 1A). Con el fin de tener suficientes neuronas DRG para una placa de 24 pocillos, recoja todo el DRG cervical a lumbar de una rata recién nacida (lo que equivale a 52 DRG) por placa.
- Cortar las proyecciones periféricas (neurales) y centrales (raíces) de DRG por medio de unas tijeras. Dejar las proyecciones en su lugar impide la trituración y aumenta el riesgo de contaminación del cultivo por fibroblastos.
- En el caso de las neuronas MP, se extirpa el mesenterio del intestino delgado y se retira manual y cuidadosamente la capa seromuscular del intestino delgado (para un protocolo detallado sobre el aislamiento de MP, Figura 1B). Para MP, recoja el plexo de dos ratas por placa de 24 pocillos.
nota: Procura ser lo más suave posible para evitar desgarros en la capa seromuscular, ya que impiden su separación exitosa del intestino delgado.
- Recoja el DRG y la capa seromuscular en un medio esencial mínimo (MEM) helado suministrado con gentamicina (20 mg en medio de 500 ml) y metronidazol (2,5 mg en medio de 500 ml).
- Después de la recolección de DRG, incubarlos en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) suministrada con colagenasa tipo II durante 20-30 min. Para el aislamiento de MP, incubar en colágeno tipo entre 1-3 h, dependiendo de la edad del animal (Figura 1C).
- En el caso de la MP, recoja las piezas de MP en forma de red bajo un microscopio estereoscópico y transfiéralas a MEM heladas.
- A continuación, triture el DRG y el MP a través de jeringas con diámetro decreciente.
nota: La trituración excesiva puede destruir las neuronas, pero no tanto las células gliales.
- Una vez que el medio que contiene el DRG o MP se haya vuelto turbio, centrifugar la suspensión a 93,9 x g durante 5 min, desechar el medio y resuspender en medio Neurobasal (suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina y 2% de B-27).
- Cuente el número total de células (es decir, neuronas Y glía) por medio de un hemocitómetro.
nota: El número de celdas necesarias depende del parámetro de medición. Para la cuantificación de la densidad de neuritas, se necesitan cultivos más densos y, por lo tanto, un mayor número de células que para la medición del crecimiento de las neuritas, el tamaño pericarioal y el patrón de ramificación de las neuronas individuales. Para las mediciones de la densidad de neuritas, utilice, por ejemplo, 10.000 células (neurona+glía)/pocillo o 1.500 neuronas/pocillo. Para la morfometría de neuronas individuales, se recomienda una breve tripsinización (de 1 minuto de duración) de las células y la siembra de 2.500 células/pocillo o 400 neuronas/pocillo. El rendimiento típico de células obtenidas de una rata es de alrededor de 300.000-500.000 células.
- Siembre las células en cubreobjetos de 13 mm que se hayan recubierto la noche anterior y cubra los pocillos con medio Neurobasal (suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina y 2% de B-27) (Figura 1D)
nota: Utilice cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (40 mg/m2) O recubiertos de ornitina y laminina (1 mg/ml cada uno). Las células se adhieren a la poli-D-lisina extremadamente rápido, por lo que es adecuado para experimentos en los que se necesitan muchas células (es decir, mediciones de densidad de neuritas). La unión a la laminina es en general algo más débil, pero la laminina es un fuerte promotor del crecimiento de neuritas. Por lo tanto, para las mediciones de la ramificación neuronal y la longitud de la neurita, prefiera el recubrimiento de ornitina/laminina.
- Permita que las celdas se adhieran a los pozos durante la noche. Al día siguiente, prepare el medio suplementado con extracto (a una concentración final de extracto/sobrenadante de 100 μg/ml).
- Aspire el medio de siembra y realice un lavado opcional muy suave con PBS, y luego pipetee lentamente el medio suplementado con extracto/sobrenadante (Figura 1E).
- Deje que las células crezcan durante 48 horas. Aspire el medio y fíjelo en paraformaldehído al 4% para la inmunotinción (Figura 1F).
- Realizar una tinción de inmunofluorescencia doble utilizando marcadores específicos de neurona (p. ej., beta III-tubulina) y específicos de la glía (p. ej., proteína ácida fibrilar glial/GFAP) (Figura 1G).
- Para la morfometría, utilice un microscopio óptico invertido equipado con una cámara CCD en combinación con un software automatizado que permita la medición de la densidad de neuritas (ver tabla).
- La densidad de neuritas de los cultivos neuronales se mide en 4-5 fotomicrografías representativas con un aumento de 200x de 4 regiones diferentes de crecimiento más denso en cada cubreobjetos superponiendo una cuadrícula de 50 μm x 50 μm y contando la densidad de fibras por cuadrado medida en las fibras que se cruzan. El crecimiento de las neuritas, el número medio de ramas por neurona, la longitud media de las ramas y el tamaño pericarional, se pueden medir a partir de 30 neuronas solitarias seleccionadas al azar de cada cubreobjetos marcando las neuritas y el pericario (Figura 1H).
