Ensayo de fosfatasa en células de CCR: un método para examinar el estado de fosforilación de la proteína tau en células de cáncer colorrectal

Resumen

Fuente: Huda, M. N., et al. Ensayo para la fosforilación y la unión de microtúbulos junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe un protocolo para evaluar el estado de fosforilación de la proteína tau mediante un ensayo de fosfatasa en células de cáncer colorrectal. La enzima fosfatasa actúa sobre los grupos fosfato presentes en la proteína tau, aumentando la movilidad de la proteína tau en el gel SDS PAGE en comparación con las muestras de proteína tau no tratadas.

Protocolo

1. Ensayo de fosfatasa

1. Trate los lisados celulares cuando las células alcancen ~65% de confluencia (aproximada mediante microscopía), retire el medio suplementado con MEM y agregue MEM sin suero con 5 μM, 10 μM y 30 μM de curcumina o 25 mM, 50 mM y 100 mM de LiCl. Incubar a 37 °C durante 24 h en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO₂, 24 h después del tratamiento, lavar las células con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y raspar las células con un raspador de células. Transfiera las células raspadas a tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifugue durante 4 minutos a 1.800 x g a 4 °C para obtener gránulos de celdas. Lisear las células suspendiendo los gránulos en 100 μL de tampón RIPA completo a 4 °C durante 20 min mientras golpea regularmente los tubos. Sonicar las muestras brevemente. Centrifugar los homogeneizados celulares en una centrífuga de sobremesa a 22.570 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera los sobrenadantes a otros tubos marcados con una pipeta) con fosfatasa alcalina en el tampón de fosfatasa alcalina.
   1. Tanto para las muestras de control como para las tratadas, prepare muestras de 20 μL que contengan 20 μg de proteína total. Agregue el volumen de lisados celulares que contiene 20 μg de proteína total, seguido de 2 μL de tampón de fosfatasa alcalina y 10 μL de fosfatasa alcalina. Agregue agua destilada para completar 20 μL.
2. Incubar las muestras a 37 °C durante 1 h. Detener la reacción añadiendo ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración final de 50 mM, o añadiendo ortovanadato de sodio (Na₃VO₄) a una concentración final de 10 mM. La reacción también se puede detener calentando a 75 °C durante 5 minutos.
3. Antes de que finalice la incubación de muestras con fosfatasa, prepare muestras de la misma concentración sin agregar fosfatasa para compararlas con muestras tratadas con fosfatasa.
4. Añada el tampón de carga de gel 4X SDS recién preparado que contiene 400 mM de TDT.
5. Incubar las muestras en un bloque de calor a 100 °C durante 5 min. Mezclar las muestras con un vórtice. Deje enfriar a temperatura ambiente durante ~10-15 min.
6. Montar un sistema de electroforesis para ejecutar un gel de poliacrilamida al 10% de SDS-PAGE.
   1. Cargue 10 μg de proteína (13 μL de muestra) por pocillo en un gel de poliacrilamida al 10%. Cargue la escala de peso molecular.
   2. Después de cargar la muestra, conecte los electrodos positivo y negativo del sistema de electroforesis a una fuente de alimentación para mantener un voltaje constante. Inicialmente, comience con 70 V durante 20 minutos para mover las muestras de proteínas del gel de apilamiento al gel de resolución. A continuación, aumente el voltaje a 125 V y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70-120 minutos hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel.
   3. Una vez finalizada la electroforesis, transfiera el gel a una membrana de PVDF mediante un sistema de electrotransferencia húmeda. Transfiera durante ~ 100 min a 100 V.
   4. Marque la mancha haciendo un pequeño corte en el costado de la escalera de peso molecular. Use una hoja de plástico transparente y un cortador afilado para cortar la mancha.
7. Bloquee la membrana en un tampón de bloqueo BSA al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente.
8. Incubar el blot en una solución de anticuerpos primarios (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C durante la noche. Lave la mancha en PBST cuatro veces, durante 7 minutos cada una.
9. Prepare la solución de anticuerpos secundarios correspondiente (IgG anti-ratón de cabra a 1:5.000) e incube el blot durante 90 min a temperatura ambiente. Lavar en PBST cuatro veces, durante 7 minutos cada una.
10. Revele la mancha utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cubra la mancha con una envoltura de plástico transparente. Adquiera imágenes mediante un sistema de imágenes de quimioluminiscencia para la quimioluminiscencia con el software correspondiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Célula HCT 116	ATCC	CCL-247
Plato de 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Conservar a -20 °C
Anticuerpo anti-Tau 13	Abcam	AB19030
Ditiotreitol (TDT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
curcumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
Anticuerpo anti-Tau (fosfo S396)	ABCAM	AB109390
FastAP Fosfatasa alcalina termosensible	Termo Científico	EF0651	Conservar a -20 °C
PMSF	sigma	Página 7626	Almacenar a temperatura ambiente
Cóctel de inhibidores de la fosfatasa	Señalización celular	5870	Almacenar a 4 °C
Cóctel de inhibidores de proteasa	Señalización celular	5871	Almacenar a 4 °C
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-11005	Almacenar a 4 °C en la oscuridad
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Affymetrix	75819
Generador de imágenes moleculares	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Almacenar a 4 °C
Búfer RIPA	sigma	R 0278	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Almacenar a unos 25 °C
Membrana de PVDF	Bio-Rad	162-0177
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-11005	Almacenar a 4 °C en la oscuridad
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Affymetrix	75819
Reactivo de colorante para ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0006
Desmembrador sónico	Fisher Científico	Modelo 500
Centrífugas de microlitros	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R