Ensayo de fosfatasa en células de CCR: un método para examinar el estado de fosforilación de la proteína tau en células de cáncer colorrectal

Resumen

Fuente: Huda, M. N., et al. Ensayo para la fosforilación y la unión de microtúbulos junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe un protocolo para evaluar el estado de fosforilación de la proteína tau mediante un ensayo de fosfatasa en células de cáncer colorrectal. La enzima fosfatasa actúa sobre los grupos fosfato presentes en la proteína tau, aumentando la movilidad de la proteína tau en el gel SDS PAGE en comparación con las muestras de proteína tau no tratadas.

Protocolo

1. Ensayo de fosfatasa

1. Trate los lisados celulares cuando las células alcancen ~65% de confluencia (aproximada mediante microscopía), retire el medio suplementado con MEM y agregue MEM sin suero con 5 μM, 10 μM y 30 μM de curcumina o 25 mM, 50 mM y 100 mM de LiCl. Incubar a 37 °C durante 24 h en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO₂, 24 h después del tratamiento, lavar las células con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y raspar las células con un raspador de células. Transfiera las células raspadas a tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifugue durante 4 minutos a 1.800 x g a 4 °C para....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Célula HCT 116	ATCC	CCL-247
Plato de 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Conservar a -20 °C
Anticuerpo anti-Tau 13	Abcam	AB19030
Ditiotreitol (TDT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
curcumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
Anticuerpo anti-Tau (fosfo S396)	ABCAM	AB109390
FastAP Fosfatasa alcalina termosensible	Termo Científico	EF0651	Conservar a -20 °C
PMSF	sigma	Página 7626	Almacenar a temperatura ambiente
Cóctel de inhibidores de la fosfatasa	Señalización celular	5870	Almacenar a 4 °C
Cóctel de inhibidores de proteasa	Señalización celular	5871	Almacenar a 4 °C
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-11005	Almacenar a 4 °C en la oscuridad
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Affymetrix	75819
Generador de imágenes moleculares	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Almacenar a 4 °C
Búfer RIPA	sigma	R 0278	Temperatura de almacenamiento: 2–8 °C
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Almacenar a unos 25 °C
Membrana de PVDF	Bio-Rad	162-0177
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-11005	Almacenar a 4 °C en la oscuridad
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Affymetrix	75819
Reactivo de colorante para ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0006
Desmembrador sónico	Fisher Científico	Modelo 500
Centrífugas de microlitros	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R