Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.
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Artículo de método
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
En respuesta a una variedad de ligandos extracelulares, el STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) factores de transcripción son rápidamente contratados en su estado latente en el citoplasma a los receptores de superficie celular en el que se activan por fosforilación en un único residuo de tirosina 1. A continuación, dímeros y trasladar al núcleo para conducir la transcripción de genes diana, lo que afecta el crecimiento, la diferenciación, la homeostasis y la respuesta inmune. No es de extrañar, dada su amplia participación en los procesos celulares normales, la desregulación de la función STAT contribuye a la enfermedad humana, en particular con el cáncer y enfermedades autoinmunes 2 3.
Está bien establecido que la transcripción está regulada por la alteración de la plantilla de 4,5 cromatina. Estas alteraciones incluyen las actividades de la ATP-dependientes de los complejos, así como covalentes modificaciones de las histonas y la metilación del ADN 6. Debido a la activación de STAT de la expresión génica es a la vez rápido y transitorio, se requiere de mecanismos específicos para la modulación de la plantilla de la cromatina en los loci de genes dependientes de STAT. Para definir estos mecanismos, que caracterizan a la modificaciones de las histonas y la actividad enzimática que los generan en los loci de genes que responden a STAT de señalización. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina, un método que es valioso para el estudio de STAT de señalización de la cromatina en la expresión de genes activados.
Protocolo
PLANIFICACIÓN
El día antes de un experimento de chip está previsto, las células deben ser cultivadas de manera que un número suficiente esté disponible. Supongamos que cada chip de ensayo requerirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Siempre el plan de hacer las dos cosas los controles negativos (IgG) y positivo (anticuerpos histona pan) y los experimentos duplicados.
Sugerencia - Para obtener las células 2FTGH, cada chip de ensayo requiere alrededor de un 15 cm placa de cultivo de tejidos en la confluencia del 80%.
PARTE 1: Preparar la cromatina y REALIZAR chip
- Eliminar los medio....
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Discusión
El protocolo indica chip se ha utilizado con éxito en el laboratorio de ensayo de más de veinte diferentes modificaciones de las histonas. Además, se han caracterizado los cambios en la ocupación de los factores de transcripción, histonas modificación de enzimas, proteínas que reconocen modificaciones de las histonas y el ARN polimerasa II maquinaria de transcripción, en varios de IFN-γ inducida por los genes. También hemos utilizado el procedimiento para caracterizar los cambios en las modificaciones de las histonas du.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Virginia, la Universidad de Virginia y el Centro de Cáncer F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Damos las gracias al James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) para las líneas celulares.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Formaldehído al 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Cloroformo/alcohol isoamílico | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Inhibidores completos de proteasas Mini | Roche Group | 1836153 | |
| Suero de ternera cósmico | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Etil alcohol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glicina | Roche Group | 100149 | |
| Glicógeno | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Acetato de sodio | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Sal sódica del ácido desoxicólico | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-histona H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Fenol/cloroformo/isoamilo | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinasa K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAsa A | 5 PRIME | 2500130 | |
| ADN de esperma de salmón/agarosa de proteína A | EMD Millipore | 16-157 | |
| ADN de esperma de salmón/agarosa de proteína G | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tritón X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA polimerasa II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
Referencias
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
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Reimpresiones y permisos
