Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Protocolo

Reacción de la transcriptasa inversa

A su vez un calentador a 70-80 ° C y 42 ° C. Baños de agua también se puede utilizar en este paso. Si utiliza bloques de calentamiento, poner un poco de agua para que el calor es uniforme.

1. Cebado reacción
   1. Tomar 3 g de ARN
   2. Ajustar el volumen a 13 ml con agua libre de RNasa
   3. Añadir 2,5 l de azar hexamer primers (2mg/ml)
2. Mezclar bien e incubar a 70-80 ° C durante 8 minutos. Después, coloque en hielo durante 5 min.
3. Preparar cócteles RT (14,5 l / rxn):
   
   

   Componente

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoalilo)-2’desoxiuridina-5’trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	Conjunto de dNTP 100 mM, grado PCR
Primeros hexaméricos aleatorios		Amersham	27-2166-01	3 mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200 U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Paquete de colorante reactivo post-etiquetado
QIAquick		Qiagen	28104	Kit de purificación de PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Tampón			Para preparar un tampón fosfato 1 M (KPO4, pH 8,5-8,7), mezcle: 9,5 mL de K2HPO4 1 M y 0,5 mL de KH2PO4 1 M
Tampón de lavado fosfato	Tampón			Para 100 mL de tampón de lavado fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80 % EtOH), mezcle: 0,5 mL de KPO4 1 M pH 8,5 + 15,25 mL de agua MilliQ + 84,25 mL de etanol al 95 %. El tampón de lavado estará ligeramente turbio. **IMPORTANTE: El tampón de lavado fosfato debe prepararse diariamente.
Tampón de elución fosfato	Tampón			Diluya KPO4 1 M, pH 8,5 hasta 4 mM con agua estéril
Tampón de carbonato sódico				(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. Disuelva 4,2 g de NaHCO3 en 80 mL de agua estéril y ajuste el pH a 9,0 con NaOH 10 N; complete el volumen hasta 100 mL con agua estéril. Para preparar una solución 50 mM para la reacción de acoplamiento del colorante, diluya 1:10 con agua. Nota: El tampón de carbonato cambia de composición con el tiempo; prepárelo fresco cada dos semanas o mes.