Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Protocol

Reacción de la transcriptasa inversa

A su vez un calentador a 70-80 ° C y 42 ° C. Baños de agua también se puede utilizar en este paso. Si utiliza bloques de calentamiento, poner un poco de agua para que el calor es uniforme.

1. Cebado reacción
   1. Tomar 3 g de ARN
   2. Ajustar el volumen a 13 ml con agua libre de RNasa
   3. Añadir 2,5 l de azar hexamer primers (2mg/ml)
2. Mezclar bien e incubar a 70-80 ° C durante 8 minutos. Después, coloque en hielo durante 5 min.
3. Preparar cócteles RT (14,5 l / rxn):
   
   

   Componente

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoalilo)-2' desoxiuridina-5'-trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set
PCR grade Random Hexamer cebadores		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Paquete de colorantes reactivos posteriores al etiquetado
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Kit de purificación
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M Tampón				Para hacer un tampón de fosfato 1M (KPO4, pH 8,5-8,7) combine: 9,5 mL 1M K2HPO4 y 0,5 ml 1M KH2PO4
Tampón de lavado de fosfato	Tampón			para 100 mL Tampón de lavado de fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) mezcla: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 mL de agua MilliQ + 84,25 mL de etanol al 95%. El tampón de lavado estará ligeramente turbio.** IMPORTANTE: El tampón de lavado de fosfato debe prepararse a diario.
Tampón de elución de fosfato	Tampón			Diluido 1 M KPO4, pH 8,5 a 4 mM con agua estéril
Tampón				(Na2CO3): 0,5M, pH 9,0. Disuelva 4,2 g de NaHCO3 en 80 mL de agua estéril y ajuste el pH a 9,0 con NaOH 10 N; Lleve el volumen hasta 100 mL con agua estéril. Para hacer una solución de 50 mM para la reacción de acoplamiento del colorante, diluya 1:10 con agua. Nota: El tampón de carbonato cambia de composición con el tiempo; Hazlo fresco cada dos semanas o un mes.