Factores de la célula huésped juegan un papel crítico en el establecimiento y mantenimiento de sarcoma de Kaposi (SK). Resumimos los métodos para identificar los factores de la célula huésped alterada en las células infectadas por HVSK DMVEC, y en el tejido tumoral KS. Genes celulares alteradas por el virus servirá como posible objetivo (s) de nuevas terapias.
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Artículo de método
La identificación de genes inducida por la desregulación de Sarcoma de Kaposi asociado al virus del herpes (HVSK)
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Resumen
Resumen
Actualmente KS es el más predominante del VIH / SIDA relacionados con tumores malignos en el sur de África y de ahí el mundo. 1,2 Se caracteriza por ser un tumor angioproliferative de las células endoteliales vasculares y produce enfermedades raras células B linfoproliferativos en forma de linfomas derrame pleural (PEL) y algunas formas de enfermedad de Castleman multicéntrica. 5.3 Sólo 1.5% de las células KS lesiones apoyar activamente la replicación lítica del sarcoma de Kaposi asociado al virus del herpes (HVSK), el agente etiológico asociado con sarcoma de Kaposi, y está claro que los factores celulares que interactuar con factores virales en el proceso de oncogénesis y la progresión del tumor 6,7. Identificación de la novela factor del huésped determinantes que contribuyen a la patología de KS es esencial para el desarrollo de marcadores de pronóstico para la progresión tumoral y la metástasis, así como para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del sarcoma de Kaposi 8. Los detalles del vídeo que acompaña a los métodos que utilizamos para identificar a la célula huésped programas de expresión de genes alterados en las células endoteliales microvasculares dérmicas (DMVEC) después de la infección HVSK y en el tejido tumoral KS. 9 Una vez que los genes desregulados son identificados por análisis de microarrays, los cambios en la expresión de la proteína se confirmada por inmunoblot y la inmunofluorescencia doble etiquetado. Cambios en la expresión transcripcional de genes desregulados se confirmó in vitro por cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR). La validación de los resultados in vitro usando tejidos de archivo tumor KS también se realiza por inmunohistoquímica doble etiquetado y de microarrays de tejidos 8,10. Nuestro enfoque para identificar los genes que están alteradas en el microambiente del tejido del tumor KS permitirá el desarrollo de la in vitro y, posteriormente, en los sistemas modelo in vivo para descubrimiento y evaluación de nuevos terapéuticos potenciales para el tratamiento del sarcoma de Kaposi.
Protocolo
1. KSVH cultivo y la infección de DMVEC
- La línea celular BCBL-1, originalmente aislado de un linfoma de cavidades corporales basados en humanos, se cultiva en completo RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 se extraen células del nitrógeno líquido, transportado en hielo seco, y rápidamente se descongela durante 1 minuto a 37 ° C. Una alícuota de 50 L de BCBL-1 en las células a una densidad de 1x10 4 células / ml a 500 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina 1x / estreptomicina y se distribuye en frascos de 175 cm, a 50 ml / frasco .
- Los frascos de BCBL-1 células se incubaron a 37 º C en una a....
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Discusión
Las metodologías utilizadas en este informe se puede realizar en una variedad de entornos de laboratorio. Que requieren algún equipo especial o acceso a instalaciones básicas. Las debidas precauciones se deben tomar al hacer experimentos con virus patógenos infecciosos como HVSK que puede requerir el uso de un nivel biosaftey 3 (BSL-3) instalaciones. Adquisiciones de los tejidos también debe ser aprobado por las juntas de revisión institucional adecuado (IRB).
Estas metodologías en conjunto .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a James EK Hildreth, Meharry Medical College, por su asesoramiento y revisión de este manuscrito. También queremos agradecer a Diana Marver para la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Meharry Vanderbilt para la Investigación del SIDA (NIH P30 AI054999-05), el Centro de Salud SIDA disparidades de Investigación, NIH RR019192 5U54-05, el Centro de Meharry de Investigación Clínica, de Subvenciones del NIH P20RR011792, y por el NIH conceder P01 CA113239. DJA fue parcialmente financiado por las subvenciones piloto del Centro Vanderbilt-Meharry for AIDS Research (CFAR) y el Centro para la Investigación Clínica Meharry (CRC). <....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7,4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Butirato de sodio | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| Medio EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | + suplemento de kits de balas |
| Células DMVEC (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Suero de ternero fetal | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Placas con cámaras | Nalge Nunc international | 154461 | |
| Ac. m. LANA del VHSK | Vector Laboratories | VP-H913 | dilución 1:50/IFA |
| Ac. p. caprino contra galectina-3 | R&D Systems | AF1154 | |
| Asno anti-cabra FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Asno anti-cabra Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | dilución 1:100/IFA |
| Medio de montaje | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield con DAPI |
| Kit de ensayo de proteína BCA | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocelulosa | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Conj. asno anti-cabra | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Sustrato para Western | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotina-conejo anti cabra | Dako | 305-065-045 | |
| Conj. AP-estreptavidina | Dako | K 0492 (kit) | |
| Conjunto RNasa sin DNasa | Qiagen | 79254 | |
| Ciclador MJ Mini | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Biofotómetro | Eppendorf | 952000006 | |
| Centrífuga RC 6 Plus | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Ultracentrífuga Coulter Optima L-90K | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| Sistema de detección de PCR en tiempo real MYiQ iCycler | Bio-Rad | 170-9770 | |
| Microscopio fluorescente TE 2000S | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalizador | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Centrífuga Sorvall Legend RT | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
Referencias
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
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Reimpresiones y permisos
