Con el fin de examinar la expresión de genes en el tejido del ala pupal de Bicyclus anynana, presentamos un protocolo optimizado para hibridaciones in situ utilizando riboprobes. También proporcionar directrices para la optimización de este protocolo para su uso en las alas de las especies de lepidópteros pupal otros.
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Artículo de método
En el Protocolo situ de Alas de Mariposa pupa Con ribosondas
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Resumen
Resumen
Aquí presentamos, en formato de vídeo, un protocolo para hibridaciones in situ en las alas de la crisálida de mariposa anynana Bicyclus con riboprobes. Hibridaciones in situ, uno de los pilares de la biología del desarrollo, son útiles para estudiar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica en el desarrollo de los tejidos a nivel de la transcripción. Si los anticuerpos que se dirigen los productos de proteína de la transcripción de genes todavía no se han desarrollado, y / o hay varias copias del gen de una proteína en el genoma que no se puede diferenciar el uso de anticuerpos disponibles, en situs se puede utilizar en su lugar. Mientras que una técnica in situ para los discos de ala larval ha estado disponible para la comunidad de mariposas durante varios años, el actual protocolo ha sido optimizado para las alas más grandes y más frágiles de pupa.
Protocolo
DIA 1
- Prepare las siguientes soluciones:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH2O
- Añadir DEPC 0,1% de volumen total y agitar vigorosamente soluciones.
- Autoclave.
- Paraformaldehído al 4% Fix - con PBS-DEPC
- Proteinasa K solución - si precipitado se presente y agitar vigorosamente antes de retirar alícuota
- Detener la digestión Buffer
- Prehibridación Buffer
- 50:50 PBT: Buffer de prehibridación
- La hibridación de búfer
- Las soluciones deben mantenerse libres de RNasa. Uso ya sea de vidrio-ware que se ha cocido (4 horas a 250 ° C) o de plástico desechable. Pipetas serológicas son muy útiles para la confección de soluciones
- Diseccionar las alas de vez en escena pupas en PBS
- Mover las alas directamente a Fix de búfer en pozos de 24 de placa de cultivo bien a temperatura ambiente
- Fix discos durante 2 horas
- Lavado de 5 x 5 minutos en PBT
- Incubar las alas durante 3 minutos en solución de proteinasa K
- Enjuague 2 x en tampón de digestión Detener
- Lavado de 5 x 5 minutos en PBT
- Lavado de 2 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB
- Lavado de 1 x 10 minutos en PHB
- Incubar en PHB por lo menos 1 hora a 55 ° C.
- El calor desnaturaliza sonda de ARN (20-50ng necesario por tanto) (80 ° C durante 5 minutos) y añadir al tampón de hibridación (100 l que se necesita por tanto)
- Añadir la sonda a los pozos y se incuba 48 horas a 55 ° C
DÍA 3
- Lavar 4 x 5 minutos en 55 ° C PHB
- Incubar toda la noche en el PHB a 55 ° C
DIA 4
- Prepare las siguientes soluciones:
- Anticuerpos buffer de bloque
- Lavado de 1 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB
- Lavar 4 x 5 minutos en PBT
- Alas de incubar durante 1 hora en tampón de bloque a 4 ° C
- Incubar las alas en una dilución 1:2000 de anticuerpos anti-Cavar la noche a 4 ° C
DIA 5
- Prepare las siguientes soluciones:
- Detección de Buffer
- Solución en desarrollo - (envolver en papel de aluminio) sensible a la luz
- Lavar 3 x 5 minutos en PBT a temperatura ambiente
- Lavado de 7 x 5 minutos en PBT
- Enjuague alas dos veces en tampón de detección
- Desarrollar alas en 1 ml de solución de desarrollo - el tiempo de desarrollo deben ser controlados cada vez que - el tiempo de programación puede cambiar, incluso cuando se utilizan las mismas sondas y la solución de desarrollo - en general, verificación después de 5-10 minutos y luego aumentar los intervalos durante toda la noche. Placa debe ser envuelto en papel de aluminio para evitar exposición a la luz cuando no la comprobación de muestras.
- Enjuague cinco veces en el tampón de detener el desarrollo de
- Montar las alas.
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Discusión
Optimización de los protocolos existentes
Hibridaciones in situ en los discos de ala larvas se han realizado exitosamente usando discos de Precis mariposas coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. El actual protocolo ha sido adaptado de un protocolo escrito detallado disponible a petición del Laboratorio de Carroll para tinciones alas larvas. Los cambios que hemos hecho servir para dar cabida a las diferencias entre los tejidos del ala de larva y pupa. Durante pupal disecciones alas posteriores, la mem...
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Agradecimientos
Damos las gracias a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Berry Jin, Futahashi Ryo, Najmus Sahar Mahfudh, Popadic Aleksandar, Bob Reed, de apoyo técnico para ayudar a Roche en la solución de este protocolo. También queremos agradecer a William Piel para el consejo sobre la edición de la película.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Buffer de fijación | 4% Paraformaldehído en PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 en PBS | |||
| Solución de Proteinasa K | 2,5mg/ml de Proteinasa K en PBT | |||
| Buffer de detención de la digestión | 2 mg/ml de glicina en PBT | |||
| Buffer de prehibridación | Para 50 ml de PHB: 12 ml de agua tratada con DEPC + 25 ml de formamida + 12,5 ml de SSC 20x + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de esperma de salmón 10 mg/ml (libre de RNasa, desnaturalizado por calor antes de añadirlo a la solución). | |||
| Buffer de hibridación | Añadir glicógeno a 1 mg/ml al buffer de prehibridación | |||
| Buffer de bloqueo | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Conjugado con fosfatasa alcalina |
| Kit de buffer de lavado y bloqueo para DIG | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Medio de montaje acuoso Crystal Mount | Sigma-Aldrich | C0612 | Medio de montaje |
Referencias
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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Reimpresiones y permisos
