Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Resumen

Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.

Resumen

Coherente las técnicas de imagen Raman han visto un aumento dramático en la actividad durante la última década debido a su promesa de permitir sin etiquetas de imagen óptica con alta especificidad molecular ^1. La sensibilidad de estas técnicas, sin embargo, es muchos órdenes de magnitud más débil que la fluorescencia, lo que requiere mili molar ^1,2 concentraciones moleculares. Aquí se describe una técnica que puede permitir la detección de concentraciones débiles o de baja de Raman-activa las moléculas mediante la amplificación de su señal con la obtenida de dispersores Raman fuertes o abundantes. La interacción de corto láseres pulsados ​​en una muestra biológica genera una variedad de señales coherentes dispersión Raman, cada uno de los cuales llevan la información química única de la muestra. Normalmente, sólo una de estas señales, por ejemplo coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS), se utiliza para generar una imagen, mientras que los demás se descartan. Sin embargo, cuando estas señales, incluyendo CARS 3-color y mezcla de cuatro ondas (FWM), se recogen y se compara con la señal CARS, de lo contrario difícil de detectar información se puede extraer ^3. Por ejemplo, los automóviles doblemente resonante (DR-CARS) es el resultado de la interferencia constructiva entre dos señales de resonancia ^4. Demostramos cómo ajuste de los tres rayos láser para producir DR-CARS señales a los 2845 cm ^-1 vibración tramo CH en los lípidos y los 2120 cm ^-1 CD vibraciones de estiramiento de una molécula de deuterio (por ejemplo, azúcares deuterado, ácidos grasos, etc) pueden ser utilizados para investigar tanto las resonancias Raman al mismo tiempo. En estas condiciones, además de las señales de los coches de cada uno de resonancia, una combinación de DR-CARS señal de sondeo tanto también se genera. Demostramos cómo detectar la diferencia entre la señal de DR-CARS y amplificar la señal de vibración de una molécula abundante se puede utilizar para aumentar la sensibilidad de la señal más débil. Además, demuestran que este enfoque se extiende incluso a aplicaciones en las que ambas señales son generadas a partir de moléculas diferentes, de tal manera que por ejemplo, con la fuerte señal Raman de un disolvente se puede mejorar la señal débil Raman de un soluto diluido.

Protocolo

1. Generación de coches y señales de DR-CARS

Con el fin de generar CARS y DR-CARS señales simultáneamente, tres ajustable y sincronizada fuentes láser de pulsos cortos son obligatorios.

1. Para obtener tres pulsos sincronizados de empezar con un solo láser de 10 W (PicoTrain, HighQ láser, Inc.). Este láser tiene una longitud de onda fija de 1064 nm, con una longitud de pulso fijo del 7 ps, y una tasa de repetición fijo de 76 MHz.
2. Utilizando una serie de placas de media onda y polarización divisor de haz cubos de la viga se divide en tres partes. Una placa de media onda en combinación con un haz de polarización cubo divisor nos permite ajustar la cantidad de energía en cada componente de la viga sin cambiar su dirección. Normalmente, los dos haces se ajustan a ~ 4,5 W cada uno, y el haz de tercero contiene el resto de 1 W.
3. Los dos haces de alta potencia se dirige entonces en dos osciladores independientes óptico paramétrico (OPO es, Avante, APE GmbH, Berlín, Alemania). OPO diferencia de uso de frecuencias para convertir la generación de un fotón de energía más alto en dos fotones de menor energía con diferentes longitudes de onda. Mediante el control de la temperatura del cristal utilizado para lograr este efecto, las longitudes de onda de los fotones resultantes pueden ser controlados de 0,1 nm. Por la frecuencia de duplicación de estas señales, un láser con una longitud de onda de 1064 nm fija ahora se puede transformar en un rayo láser que se pueden sintonizar en cualquier lugar entre 780 nm y 910 nm. Mediante el bombeo de dos por separado OPO con la fuente nm mismo 1064, se obtiene de dos fuentes de láser sintonizables independiente que se sincroniza automáticamente con nuestro láser de bombeo original.
4. La tercera (menor potencia) del haz del láser de 1064 nm bomba se dirige todo el de Oporto por una combinación de espejos dicroicos para que los tres haces (2 de la OPO, uno de los láser de bombeo) se pueden recombinar más tarde. Con el fin de producir de manera eficiente coherente fotones de la señal Raman los pulsos recombinados deben ser superpuestas, tanto temporal como espacialmente. Porque OPO contienen cavidades anillo, permitiendo que cada pulso de láser para pasar a través de los tiempos múltiples de cristal, los rayos enviados a través de los viajes del OPO es una distancia adicional que resulta en un retraso considerable en relación con el haz de bombeo original. Esta distancia debe ser compensada con el haz de tercero mediante la introducción de espejos adicionales que obligan a este rayo en recorrer la misma distancia que los otros dos antes de que se vuelven a combinar el uso de espejos dicroicos.
5. A fin de proporcionar un ajuste fino de la longitud de la trayectoria de cada rayo viaja etapas de retardo ajustable, con retrorreflectores prisma, se introducen en cada paso del haz.
6. Otro conjunto de placas de media onda y polarización cubos divisor de haz se añaden a cada haz que nos permite ajustar la potencia de cada haz de forma independiente sin afectar a la entrada de la de Oporto.
7. Espejos dicroicos se utilizan para combinar primero las vigas de la OPO en dos y luego con el haz de onda de 1064 nm. Se debe tener cuidado para asegurar que las vigas son, precisamente, se superponen (es decir, están alineados, y tienen una divergencia similar). Esto se puede comprobar mediante la comparación de la superposición de los haces de cerca (dentro de unos pocos centímetros) y muy lejos de (~ 1 m) del espejo dicroico.
8. La ventaja de utilizar los láseres pulsados ​​es que cada pulso puede tener un pico de energía de alta en la muestra, lo que permite la generación eficiente de las señales de Raman coherente, manteniendo una intensidad media baja. Una intensidad media alta puede dañar la muestra. Por lo tanto, con el fin de controlar mejor la intensidad media, sin sacrificar el pico de energía, los tres haces combinados se envían a través de un modulador electro-óptico (células Pockel, el ConOptics) que funciona como un selector de pulso, que nos permite ajustar la tasa de repetición de los pulsos que llegar a la muestra y por lo tanto, la intensidad media.
9. Los rayos láser se combinan entonces junto a un microscopio invertido con un objetivo de alto NA. El objetivo es normalmente un 60 X agua lente del objetivo con una apertura numérica (NA) de 1.2 que se ha corregido la aberración cromática en toda la gama de ajustabilidad de los nuestros OPO y el haz de onda de 1064 nm. El estrecho enfoque generado por la lente del objetivo de alto NA permite la generación más eficiente de las señales de Raman coherente en la escala del micrón.
10. Los haces se combinan ampliado con el fin de llenar en exceso la parte de atrás-puerto del objetivo del microscopio. Por sobrecargar la parte de atrás de el objetivo del microscopio podemos lograr las mejores condiciones de enfoque y por lo tanto, la mejor resolución espacial en nuestro sistema de microscopio.
11. La lente del objetivo de nuestro microscopio se monta en un escenario XYZ piezo que nos permite obtener imágenes de mapa de bits de detección de los rayos a través de la muestra, similar a la exploración comercial de haz microscopios confocal.

2. El uso de tres láseres pulsados ​​corto

El uso de los tres resultados a corto pulso láser en la producción de señales de varios coches, de los diferentes combinations de dos rayos láser, así como los coches de 3 colores y el DR-FWM señales de la combinación de los tres rayos láser.

1. Las longitudes de onda de las señales puede mentir espectralmente cerca uno del otro. Cuando las señales están muy juntas, puede ser difícil de separar para el análisis utilizando filtros de banda de longitudes de onda fija y espejos dicroicos. Por esta razón, nuestras señales se pasan a un espectrómetro de imágenes (SpectraPro 2300i, Acton Research), que también sirve como un monocromador eficiente para separar espacialmente las señales a diferentes longitudes de onda.
2. Un espejo accionado electrónicamente tirón en el espectrómetro, en la posición baja envía la señal a un retroiluminado profundo agotamiento del dispositivo de carga acoplada (CCD) que proporciona información espectroscópica en todo el rango de la señal completa y nos permite identificar y optimizar los diversos coherente señales Raman.
3. Para seleccionar la señal con la que queremos que la imagen basta con girar la rejilla en el espectrómetro, con el que ofrece el proveedor de software de control y adquisición de datos (WinSpec, Princeton Instruments), al centro del pico de interés de la cámara CCD y luego cambiar el posición del espejo del tirón a redirigir la señal a un puerto de segunda salida a la que ha sido una avalancha de conteo de fotones simples fotodiodo (APD) adjunto.
4. La lente del objetivo es entonces raster escaneados y las señales registradas en la APD se utilizan para generar una imagen que muestra el conteo de fotones de cambio para cada píxel a través del software de adquisición de datos (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlín, Alemania).
5. Repetimos este procedimiento para cada imagen deseada de la señal Raman coherente que nos permite comparar las señales durante el post-procesamiento.

3. Preparación de la muestra

Con el fin de obtener imágenes claras y reproducibles algunos se debe tener cuidado en la preparación de la muestra.

1. Las muestras se preparan típicamente en ~ 150 micras de espesor cubreobjetos de vidrio. Estas laminillas son lo suficientemente delgada como para permitir obtener imágenes de alta resolución con el 1,2 NA objetivos que se utilizan normalmente.
2. Captura óptica de los objetos dieléctricos puede ocurrir cuando la luz del láser se difracta a través de pequeños objetos transparentes. El uso de una fuerte orientación, la potencia pico alto, corto rayos láser pulsado continuación, puede arrastrar pequeñas células o bacterias a lo largo, lo que resulta en imágenes borrosas o manchadas. A fin de evitar esto, puede ser necesario inmovilizar la muestra sobre la superficie del cubreobjetos aplicando primero una capa fina de poli-L-lisina por spin-coating.
3. De las células en cultivo de vidrio placas de cultivo inferior se puede utilizar que permiten obtener imágenes sin la necesidad de separar las células de sus platos de crecimiento de cultivos celulares.
4. Para la demostración de esta contribución en primer lugar un depósito C. formaldehído-fijo elegans gusano nematodo en una hoja de cubierta de vidrio.
5. A continuación, agregue una gota de 20 l de solución de glucosa al 5 M deuterado con el gusano. La solución de glucosa deuterado proporciona una firma Raman experiencia única y fuerte.

4. Análisis de muestras

Con el fin de aprovechar adecuadamente el efecto de mejora doblemente resonante de los espectros Raman de ambas sustancias Raman resonante debe ser conocido.

1. Una vez que la muestra se prepara en el cubreobjetos se analiza con un microscopio confocal de Raman para obtener el correspondiente espectro Raman espontánea e identificar picos adecuados.
2. Para llevar a cabo DR-CARS se identifican los lugares espectral de la modo de estiramiento CH, por lo general asociados con lípidos, y el modo de CD tramo, asociado a la glucosa deuterado, a 2845 cm ^-1 y 2121 ^cm-1, respectivamente.
3. Dispersión Raman coherente se logra cuando la diferencia de frecuencia entre dos rayos láser coincide con la frecuencia de una vibración molecular. Al sintonizar una OPO a 817 nm se estudiará el modo de 2.845 cm ^-1 CH cuando se combina con el rayo láser de 1064 nm y mediante la regulación del OPO otros a 868 nm se probará el 2121 cm ^-1 pico cuando se combina con el haz de onda de 1064 nm .
4. Por trama de barrido de la muestra en el microscopio CARS, ahora podemos observar tres señales coherentes Raman de interés. A COCHES señal de sondeo de la CH vibración de alargamiento, una señal de sondeo CARS el modo tramo CD, y una señal de DR-CARS sondeo ambos.
5. Seleccionamos cada pico como se describe en la Sección 2.3 y tomar una imagen como se describe anteriormente.

5. Procesamiento de imágenes

Extraer información adicional sobre la base de estas tres imágenes ahora requiere un poco de procesamiento de imágenes bastante simple.

1. En primer lugar las imágenes deben ser normalizados. En la teoría de la normalización se puede lograr por cuenta de la intensidad de cada láser que intervienen en cada proceso de generación de la señal. En la práctica, sin embargo, esto no siempre funciona, sobre todo debido a la respuesta espectral no uniformede espejos dicroicos, detectores, y rejas.
2. Un método práctico para la normalización se basa en el hecho de que en las regiones donde los lípidos puros dominan la señal, la resonancia de CD no debe contribuir a cualquiera de las señales. Del mismo modo, en las regiones de solución de glucosa pura la resonancia CH no deben contribuir a cualquiera de las señales. Con esto en mente, se normaliza la imagen DR-CARS y la imagen CARS obtenidos en la resonancia CD de la solución de glucosa deuterado a una región y fuera de la C. elegans gusano que no presentarán la resonancia CH.
3. Entonces identificar una región en el gusano en la imagen de resonancia CH-CARS que es rica en lípidos y normalizar a la región correspondiente dentro de la normalización DR-CARS imagen. Para que este método funcione correctamente se supone que en lo profundo de esta región no deuterado glucosa está presente. Esto es una suposición segura puesto que los lípidos son hidrófobos y no se mezcla con la solución.
4. Ahora, restando la normalización CH-resonante de la imagen CARS normalizado DR-CARS imagen que nos queda sólo la amplificación de la señal de CD-resonante.
5. Del mismo modo, restando la normalización CD-resonante de la imagen CARS normalizado DR-FWM la imagen que nos queda sólo el CH-resonancia amplifica la señal.

6. Resultados representante

Figura 1: Esquema del sistema de microscopía CARS DR-como se describió anteriormente.

Figura 2: imagen de luz blanca de una C. gusano elegans en una solución de glucosa deuterado preparada en un cubreobjetos y listo para su imagen.

Figura 3:. Espectro Raman de ácido oleico modificados (un ácido graso insaturado) que incluye una modificación alquino (un triple enlace carbono carbono del grupo) Las resonancias CH fuerte en 2845 cm ^-1 y la resonancia alquino a 2100 ^cm-1 son bien aislada de la región de huellas digitales (la región de gran densidad de picos para llevar), lo que los marcadores ideal para imágenes Raman coherente.

Figura 4:. Típico espectro de Raman coherente las señales generadas cuando tres rayos láser de pulso corto se superponen en la muestra Las flechas indican el proceso (s) responsables de cada señal, representado por diagramas de energía. En los diagramas que se muestran aquí las flechas discontinuas indican los fotones del láser y la de Oporto y las flechas continuas indican la señal resultante. Las líneas horizontales sólidas indican la energía de las vibraciones Raman y dar una representación visual que, en el DR-CARS, mezcla de los mismos 3 fotones de entrada de forma simultánea dos sondas diferentes vibraciones Raman.

Figura 5: Los resultados típicos de la imagen C. elegans gusanos utilizando DR-CARS y los coches. La fila superior utilizan las tres señales se indica en la Figura 4 a la imagen de un gusano en una solución de glucosa deuterado. En la segunda fila las imágenes se normalizaron de manera adecuada y en la tercera fila las imágenes fueron producidas por diferencia restando cada una de las imágenes de los coches de la imagen DR-CARS.

Discusión

Espectroscopia Raman y las imágenes Raman basado son poderosas herramientas emergentes de las ciencias bio. En la actualidad, esto es particularmente cierto para los in vivo e in vitro en el estudio del metabolismo celular y trastornos metabólicos en el procesamiento y almacenamiento de los lípidos. La mayoría de bio-macromoléculas contienen un gran número de similares, en su mayoría a base de carbón enlaces moleculares, por lo que los espectros Raman obtenidos a partir de las células y los organismos son generalmente una convolución de las contribuciones de los lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, lípidos, etc son relativamente fáciles de para aislar a partir de estos espectros complejos, debido a su tendencia a formar gotas densas o bicapas y debido a que contienen largas cadenas con un gran número de enlaces CH alifáticos. Nuestra capacidad de aislar las proteínas específicas, aminoácidos, ARN o ADN dentro del entorno celular compleja, sin embargo, muy limitada. Esto es particularmente cierto si estas moléculas de interés sólo están presentes en concentraciones M y por debajo. En este caso, la capacidad de conseguir débiles resonancias Raman utilizando nuestro recién introducido DR-CARS diferencia técnica de imagen ofrece un enfoque poderoso para su microanálisis químico y de imagen. Es cierto que la parte más complicada de este protocolo es la alineación y sincronización del sistema láser. Cuando se inicia a partir de cero, la sincronización de los pulsos, es decir, garantizar que los pulsos se superponen en el tiempo a pesar de los diferentes caminos que toman pueden ser facilitadas por el uso de un autocorrelador pulso. Superposición espacial y temporal, una vez se logra, los coches y el DR-CARS señales deben ser fácilmente detectable. Sin embargo, la primera alineación es a menudo crudo, lo que resulta en señales débiles. La mejor práctica para la alineación de este sistema así es la generación de señales débiles al principio y luego para mejorar la potencia de la señal suavemente ajustar los espejos a lo largo de cada ruta y el ajuste de la coincidencia temporal con la fase de retardo. A pesar de los actos del espectrómetro / monocromador como deflector muy eficiente para la luz ambiente más limpio se pueden lograr resultados de operación del sistema con las luces del cuarto apagada y las cortinas o los tubos de lentes para minimizar el fondo presentado por las fuentes de luz varios otros (por ejemplo, los monitores de ordenador, indicadores luminosos, LED, etc.)

Nuestra configuración particular utiliza un solo fotón contando avalancha de fotodiodos (APD) y detectores de tiempo correlacionada conteo de fotones simples (TCSPC) para la detección de hardware ^5. Esto nos permite detectar señales muy débiles de ruido relativamente bajo, pero muchos grupos se han encontrado tubos fotomultiplicadores (PMT), con ganancia variable ventaja al tomar medidas similares. La ventaja de la PMT es que ofrecen ganancia variable y tienen un área de detección mucho más grande que se puede simplificar el alineamiento del detector. Además, nuestra configuración utiliza las etapas piezoeléctrico para traducir el objetivo con el fin de lograr la exploración del haz. La ventaja de esto es que tenemos la posibilidad de regresar a cualquier punto dentro de la imagen escaneada con anterioridad con un alto grado de precisión y tomar medidas adicionales, como espectros Raman espontánea. Otros grupos han tenido éxito utilizando análisis conjuntos de espejo, o las unidades de exploración confocal incluso todo, como el sistema Olympus FluoView, que ofrece una imagen mucho más rápido, pero es limitado en su capacidad de volver precisamente a ubicaciones arbitrarias dentro de una imagen.

Puesta a punto del láser para que coincida con la resonancia Raman es también un paso crítico que puede ser necesaria una optimización. A pesar de los picos Raman se puede conocer la intensidad máxima de pico espectral obtenida de DR-CARS y los coches no se corresponde necesariamente con el máximo del pico Raman espontánea. Esto se debe a la interferencia intrínseca de las señales generadas por la mezcla de cuatro ondas dando lugar a una señal de fondo no resonante y automóviles, lo que distorsiona los espectros de CARS en relación con los espectros Raman espontánea. La ubicación del espectro del pico de la señal de los coches se pueden calcular, pero un enfoque más práctico es sintonizar el OPO en varias etapas, a través de pequeñas espectral de la ubicación prevista de la resonancia Raman. Este proceso debería producir un máximo claro. De hecho, para la mayor sensibilidad del DR-FWM resonancias tanto deben estar sintonizados a este máximo.

Un último problema potencial del enfoque DR-CARS también tiene que ser discutido, es decir, la señal de DR-CARS dependerá de una distribución homogénea de la molécula de amplificación Raman-activa. Para la mayoría de los objetos biológicos, esto bien podría ser la amplia resonancia OH del agua, que es abundante y omnipresente casi. El agua es, sin embargo, excluidas de las regiones hidrofóbicas con una célula, como las gotas de lípidos, lo que lleva una distorsión de las señales obtenidas cuando se utiliza la resonancia de agua para ampliar los modos de lípidos. En nuestro ejemplo, hemos utilizado una solución de glucosa deuterado para generar una señal fácilmente detectables y abundante de la muestra biológica. Del mismo modo, deuterado agua o deuterado buffe biológicars, como d-HEPES se podrían utilizar. En nuestro ejemplo, las gotas de lípidos en el C. gusano elegans fueron lo suficientemente pequeño como para contener siempre tanto, la solución de glucosa y lípidos deuterado en el punto del láser centrado de nuestro sistema. Sin embargo, esto no es cierto en general. Un ejemplo concreto sería adipocitos, que generan las gotas de lípidos más grandes dentro de su citoplasma. Esto significa, cualquier experimento realizado con la técnica del DR-CARS requiere una cuidadosa preparación y control de los experimentos para comprobar los resultados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo de inmersión en agua de 60X	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Microscopio invertido	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Célula de Pockels	ConOptics	350-160
Láser de bombeo Picotrain	HighQ	IC-1064-10000
Oscilador paramétrico óptico	APE	Levante IR
Portaobjetos de vidrio 1.5	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Placas de media onda	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Cubos divisores de haz polarizante	Thorlabs Inc.	PBS052 o PBS053
Espectrómetro/Monocromador	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
Cámara CCD	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Fotodiodo de avalancha	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
Plataforma piezoeléctrica XYZ	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	Esta es una combinación de una plataforma XY y un soporte Z para el objetivo
Espejos dicróicos	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	Estos espejos dicróicos específicos no son críticos; cualquier conjunto con las características apropiadas de transmisión/reflexión será suficiente.
Espejo dicróico	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	Para combinar los diferentes haces láser del infrarrojo cercano
Tarjeta TCSPC	PicoQuant	Timeharp 200
Software de imagen Symphotime	PicoQuant
Matlab	Mathworks