Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

Resumen

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas miocardio In vivo Se describen.

Resumen

Este protocolo proporciona los métodos para la preparación de un inyectable de la matriz extracelular (ECM) de gel para el infarto de aplicaciones de ingeniería de tejidos. En pocas palabras, el tejido descelularizada es liofilizada, se muele, se digiere enzimáticamente, y luego llevados a un pH fisiológico. La liofilización elimina todo el contenido de agua de los tejidos, dando lugar a ECM seco que puede ser molido en un polvo fino con un pequeño molino. Después de la molienda, el polvo de ECM es digerido con pepsina para formar una matriz de inyectables. Después del ajuste a un pH de 7.4, el material de la matriz líquida se puede inyectar en el miocardio. Los resultados de los ensayos de caracterización previos han mostrado que los geles matriz obtenida a partir de tejido de miocardio y pericardio descelularizada retener los componentes nativos ECM, incluyendo diversas proteínas, péptidos y glicosaminoglicanos. Dado el uso de este material para la ingeniería de tejidos, en la caracterización in vivo es especialmente útil, aquí, un método para realizar una inyección intramural en el ventrículo izquierdo (VI) de la pared libre se presenta como una forma de analizar la respuesta del huésped a la matriz de gel en un modelo de animal pequeño. El acceso a la cavidad torácica se obtiene a través del diafragma y la inyección se hace un poco por encima del vértice de la pared libre del VI. El origen biológico andamio puede ser visualizado por biotina-etiquetado antes de la inyección y luego teñir secciones de tejido con rábano picante y conjugado con peroxidasa neutravidin y visualización mediante diaminobencidina (DAB) tinción. Análisis de la región de inyección también se puede hacer con la tinción histológica e inmunohistoquímica. De esta manera, los geles de la matriz ya examinada pericardio y miocardio, se mostró a formar redes de fibra, porosa y promover la formación de vasos en la región de la inyección.

Protocolo

1. Pre-procesamiento de los tejidos de preparación

1. Antes de utilizar este protocolo, se debe tener ya descelularizada el tejido de elección. Para este ejemplo, fresca de porcino y muestras humanas pericardio descelularizada utilizando enjuagues hipotónica e hipertónica en agua desionizada (DI) y dodecilsulfato sódico (SDS).
2. En concreto, primero se deben lavar el pericardio porcino en agua DI durante 30 minutos, luego revolver continuamente en SDS al 1% en tampón fosfato salino (PBS) durante 24 horas, seguido de un 5 horas de agua DI enjuague. Para pericárdica humanos, primero enjuague con agua DI durante 30 minutos, luego revolver ....

Discusión

Este método permite la generación de origen biológico, andamios inyectables para la ingeniería de tejido miocárdico. Aunque estos métodos fueron desarrollados inicialmente para la fabricación y las pruebas in vivo de una matriz de gel de miocardio y que aquí se presenta con una matriz de gel pericárdico, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido, siempre que el tejido puede ser apropiada descelularizada. Descelularización se debe realizar y verificados antes de la utilización d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos:
Pepsina	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Liofilizado
Biotina	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidina-HRP	Thomas Scientific	21130
Equipamiento:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Liofilizador Labconco	Labconco Corp.	7670520
Suministros quirúrgicos:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Solución de Ringer con lactato	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaína, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Clorhidrato de buprenorfina	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Pomada ocular artificial	Fisher Scientific	NC9860843
Pomada triple antibiótica	Fisher Scientific	19082795
Isoflurano	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscopio	MWI Veterinary Supply	008699
Llave de paso	MWI Veterinary Supply	006245
Sutura Vicryl 3-0	MWI Veterinary Supply	J327H
Sutura Proline 5-0	MWI Veterinary Supply	s-1173
Aguja de corte inverso (RC)	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostatos	Fine Science Tools	13013-14
Pinzas microdentadas	Fine Science Tools	11084-07
Bisturí número 10	Fine Science Tools	10110-01
Tijeras romas	Fine Science Tools	14108-09
Tijeras curvas afiladas	Fine Science Tools	14085-08
Pinzas grandes con dientes	Fine Science Tools	1106-12
Tubo de succión PE160	BD Biosciences	427430
Afeitadoras	MWI Veterinary Supply	21608
Grapas quirúrgicas/ensartador	Ethicon Inc.	PRR35
Suministros generales:
Placas agitadoras
HCl 0,1 M
NaOH 1 M
PBS 10x
PBS 1x
Etileno al 70%
Jeringas de 0,1 mL
Jeringa de 10 mL
Hisopos
Adhesivo quirúrgico
Campos quirúrgicos
Pinzas para toallas
Aspirador pequeño portátil