Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.
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Artículo de método
Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos fármacos y otras moléculas pequeñas que se utilizan para modular la función biológica se anfifilos que adsorben en la interfase de dos capas / solución y por lo tanto alterar las propiedades de bicapa lipídica. Esto es importante porque las proteínas de membrana son energéticamente, junto a sus dos capas de acogida por interacciones hidrofóbicas. Cambios en las propiedades de dos capas por lo tanto alterar la función de proteínas de membrana, que proporciona una forma indirecta de anfifilos para modular la función de proteínas y un posible mecanismo para "fuera de objetivo" efectos de los medicamentos. Anteriormente hemos desarrollado un ensayo electrofisiológico para detectar cambios en las propiedades bicapa lipídica con canales lineales gramicidina como sondas 3,12. Los canales de gramicidina son mini-proteínas formadas por la dimerización transbilayer de dos organizaciones no-realización de las subunidades. Son sensibles a los cambios en su entorno de membrana, lo que las hace las sondas de gran alcance para vigilar los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión. Ahora demuestran un ensayo de fluorescencia para la detección de cambios en las propiedades de dos capas utilizando los mismos canales que las sondas. El ensayo se basa en la medición del tiempo-por supuesto de extinción de fluorescencia de fluoróforo cargado vesículas unilamelares grandes debido a la entrada de un extintor a través de los canales de gramicidina. Usamos la fluorescencia indicador / extintor par de 8 aminonaftaleno-1 ,3,6-trisulfonato (hormigas) / Tl + que ha sido utilizado con éxito en otros ensayos de extinción de fluorescencia 5,13. Tl + impregna la bicapa lipídica lentamente 8, pero pasa fácilmente a través de la realización de canales de gramicidina 1,14. El método es escalable y adecuado tanto para estudios de mecánica y de alto rendimiento de detección de pequeñas moléculas de doble capa-perturbadora, y su potencial "en blanco", los efectos. Nos encontramos con que los resultados con este método se encuentran en buen acuerdo con los anteriores resultados electrofisiológicos 12.
Protocolo
1. Generar HORMIGAS lleno de liposomas
- El día 1, eliminar el disolvente orgánico a partir de lípidos.
- Eliminar los lípidos del congelador y dejar que alcancen la temperatura ambiente.
- Añadir 0,6 ml de 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-fosfocolina) de lípidos en solución de cloroformo a un matraz de fondo redondo de 25 ml.
- Continuamente girar el matraz durante el secado en atmósfera de nitrógeno, hasta que todo el cloroformo se ha evaporado y una fina capa blanca de las capas de lípidos toda la mitad inferior de la botella.
- Seca en un desecador al vacío durante la noche.
- El día 2, preparar la m....
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Discusión
Hemos demostrado una rápida basada en fluorescencia de ensayo para determinar el potencial de doble capa modificación de las drogas y otros anfifilos pequeños. Los compuestos que modifican las propiedades de dos capas es probable que alteran la función de proteínas de membrana de una manera indirecta, no específica, que podría contribuir a "fuera de objetivo" efectos de los medicamentos. El ensayo explota el poder de los canales de gramicidina como sondas para cambios en las propiedades de dos capas 12
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Divulgaciones
Una solicitud de patente provisional que cubre los métodos descritos en el manuscrito se ha presentado. El co-inventores son HII y OSA.
Agradecimientos
Damos las gracias a Michael J. Bruno, Rusinova Radda y Jon T. saco de muchas discusiones estimulantes. El apoyo financiero del NIH, R01GM021342 y complementar ARRA R01GM021342-35S1, y la Josiah Macy Jr. Foundation para OSA, el Tri-I CMB programa de HII, y El Iris L. y S. Woodworth Leverett Médico Científico de becas y subvención del NIH MSTP GM07739 de RK.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | |
| gramicidina | Sigma-Aldrich | G-5002 | |
| 1,2-dierucoil-sn-glicerol-3-fosfocolina | Avanti Polar Lipid, Inc | 850398C | |
| Kit mini-extrusor | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Columna de desalinización PD-10 | Sigma-Aldrich | 54805 |
Referencias
- Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. Renal Function. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 1....
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Reimpresiones y permisos
