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1. Día 1:
MexB de Pseudomonas aeruginosa es codificada por pFB101. El gen se amplificó a partir MexB P. aeruginosa ADN genómico y se inserta en el NdeI y XhoI sitios de restricción del vector pET30b +. La construcción contiene una etiqueta hexahistidina C-terminal.
- El plásmido se utilizó para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, y los transformantes se sembraron en agar LB que contenían 30 ug / ml de kanamicina.
2. Día 2: cultivos de una noche:
- Por la noche, 4 x 3 culturas LB ml que contienen 30 ug / ml kanamicina se inoculan de las colonias transformantes fresco. Por otra parte, los cultivos pueden ser inoculados a partir de una permanente congelado.
Estas pequeñas culturas se cultivan en una montaña a 37 ° C durante la noche.
3. Día 3: Crecimiento 6 litros culturas:
- Por la mañana, el uso de las culturas durante la noche para inocular 150 ml de LB conteniendo 30 ug / ml de kanamicina. Mantener el cultivo a 37 ° C en un agitador.
- Por la tarde, el uso de la cultura pequeños para inocular 6 x 1L 2XYT los medios de comunicación que contiene 30 ug / ml de kanamicina en frascos Fernbach. (Use 25 ml por la cultura de una dilución 1:40). Crecen los cultivos a 37 ° C hasta alcanzar una OD 600 de 0.4-0.6, alrededor de 1,5 horas
- Cuando las culturas alcanzar la densidad adecuada, induce la expresión de proteínas mediante la adición de 0,5 ml de IPTG 1M. Poner todos los frascos de vuelta en la coctelera y continuar a crecer a 30 ° C durante la noche.
4. Día 4: Recolección de Células y purificar la proteína:
- Añadir inhibidores de la proteasa, ADNasa y lisozima a las soluciones tampón de la siguiente manera: A 50 ml de tampón de resuspensión de células, agregar 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml concentración final), una completa EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa, y una pizca de lisozima . A 60 ml de solución tampón de resuspensión de membrana, añadir 1 tableta de inhibidor de la proteasa. A otro de 50 ml de solución tampón de resuspensión de membrana, añadir 1 tableta de inhibidor de la proteasa. Mantener las tres soluciones en el hielo.
- Centrifugar los cultivos de 30 minutos 5.000 rpm en gran escala centrífuga para cosechar las células.
- Resuspender las células en 100 ml de tampón de resuspensión de células (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa, 0,1 mg / ml de DNAsa I, una pizca de lisozima)
- Pase la solución de células dos veces a través de una célula de presión francesa a 12.000 psi (762 presión manométrica). Recoger el lisado celular en una botella de mantenerse en frío sobre el hielo.
- Transferir el lisado celular a SS34 tubos de centrífuga y centrifugar para eliminar los desechos celulares durante 30 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C en un rotor SS-34.
- Retire con cuidado el sobrenadante en tubos Ti647.5 ultracentrífuga. Centrifugar 50 min a 40.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado, que contiene las membranas celulares, en aprox. 25 ml de buffer de resuspensión de membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, un completo EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa).
- La transferencia de la suspensión de membrana a un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 40.000 rpm en un rotor Ti647.5 durante 50 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet se lavó la membrana en 25 ml de tampón de resuspensión de membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, un completo EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa).
5. TM Solublization Proteínas:
- A las membranas se resuspendieron (unos 25 ml), añadir 6 mL DDM 10% (concentración de detergente final DDM = 2%) Rock de la mezcla a 4 ° C durante 2 horas.
- Centrifugar la mezcla a 40.000 rpm durante 40 min a 4 ° C en el rotor Ti647.5 para separar los complejos de proteínas solubles en detergente de las proteínas insolubles. Guardar el sobrenadante, que contiene los complejos de proteínas MexB detergente.
6. IMAC:
- Se mezcla el sobrenadante obtenido de la velocidad de centrifugado de alta afinidad con las cuentas garra de metal equilibrada en buffer de resuspensión. Incubar durante 1 hora en un rodillo a 4 ° C.
- Vierta la mezcla en un cuerpo de gravedad columna de flujo y descartar el flujo a través.
- Lavar la columna con 20 ml (10 volúmenes de columna) de tampón IMAC encuadernación y lavado (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 0,2% DDM)
- Eluir la proteína con tampón de elución IMAC (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM de imidazol, 0,2% DDM).
- Tomar 15 muestras l de las fracciones de elución, mezclar cada uno con 15 ul buffer 2X SDS muestra para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida. Girar 30 segundos en una microcentrífuga. Analizar las muestras en un 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar la cantidad y la pureza de MexB en cada fracción.
- Piscina de las fracciones que contienen los complejos de proteínas MexB detergente y concentrarlos en un concentrador de giro a 4 ° C. Tenga cuidado de que la proteína no se precipitan en este step.
7. Gel columna de filtración:
- Pre-equilibrar una Superose 12 HL 30/10 columna con tampón 24 mL correr (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 0,2% de beta-octilglucósido), y esperar a que una línea de base plana.
- Enjuague el sistema Akta bucle de carga con tampón en funcionamiento.
- Filtrar la solución de proteína usando un filtro de jeringa antes de aplicar a la columna.
- De carga de hasta 240 l de la solución de proteína en la columna, con una concentración de proteína de hasta 5 mg / ml.
- Ejecutar 1,5 volúmenes de columna (36 mL) de tampón, recoger las fracciones 0,25 ml. Los complejos de proteínas MexB detergente debe eluir como un pico de alrededor de 10 a 15 ml de volumen de elución.
- Tomar muestras de 5 l de las fracciones del pico. Mezcle cada muestra 1:1 con tampón de muestra 2X SDS. Analizar las muestras en un gel de poliacrilamida al 10% para estimar la cantidad y la pureza de MexB en cada fracción
- Piscina de las fracciones que contienen MexB puro.
8. Los resultados representativos:
La figura 1 incluye un gel de poliacrilamida con fracciones de columna combinada de la columna IMAC y distintas fracciones de la columna de filtración en gel. Después de la columna de filtración en gel de la proteína aparece puro gel de poliacrilamida teñidos con Coomassie. Figura 2 se incluye una traza a partir de la columna de filtración en gel que muestra el pico principal de la elución de proteínas complejas detergente de la columna. El rendimiento promedio de proteína MexB es de aproximadamente 2 mg por cada 6 litros de cultivo 2XYT.
Figura 1. SDS-PAGE gel de purificación del PDC MexB. Carril 1, marcadores de peso molecular. 2, agrupados fracciones IMAC. 3-7, Gel fracciones columna de filtración.
Figura 2. Ejemplo de los resultados de filtración en gel para los complejos de proteínas MexB detergente (PDC).