El tráfico de macromoléculas entre las células vegetales se pueden evaluar de forma transitoria que expresa una proteína fluorescente con etiquetas de interés y el análisis de su distribución intra e intercelulares mediante microscopia confocal.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Una célula a célula macromoleculares de transporte de ensayo En la Planta La utilización de bombardeo biolística
En este artículo
Resumen
Resumen
A continuación, presentamos un protocolo sencillo y rápido para detectar y evaluar la magnitud de la célula a célula de transporte macromolecular en la planta. En este protocolo, marcado con fluorescencia de proteínas de interés se expresa de forma transitoria en el tejido vegetal después de la entrega biolística de su ADN que codifica para la construcción. La distribución intra e intercelulares de la proteína marcada se analiza por microscopía confocal. Se describe en detalle esta tecnología, ofreciendo paso a paso a protocolos de ensayo y evaluar la magnitud del transporte de proteínas simplástica en tres especies de plantas, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana y N. tabacum (tabaco).
Protocolo
Fondo
Simplástica transporte de macromoléculas a través de conexiones intercelulares de plantas, los plasmodesmos, es de interés para muchos patólogos de plantas y biólogos. Por ejemplo, varias proteínas virales son conocidas para regular plasmodesmal límites de exclusión de tamaño para permitir el movimiento viral 1-3. Además, algunas proteínas endógenas, entre ellos importantes reguladores de desarrollo, se supone que se mueven de célula a célula, presumiblemente a través de los plasmodesmos, que la función no de células de forma autónoma 4. Por lo tanto, una metodología fiable para identificar y visualizar transport....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La clave para el éxito del ensayo de transporte simplástica es la obtención de la eficiencia de transformación de alto, que permite la producción de racimos de señal estadísticamente significativa y detectable fácilmente. Esto puede lograrse utilizando las hojas cosechadas de plantas sanas, robustas, y la preparación de partículas de oro recubiertas por una preparación de ADN puro y concentrado.
Utilizando las hojas en la misma etapa de crecimiento también es vital para la fiabilidad del aná.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nuestro trabajo es apoyado por becas de NIH / NIGMS, NSF, USDA / Nifa, y BARD a VC.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Micro partículas de oro, 1,0 μm de diámetro | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Micro partículas de oro, 0,6 μm de diámetro | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Espemidina | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tubo de Tefzel | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Estación preparatoria de cartuchos Helios | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Cortador de tubos | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Pistola génica Helios | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Regulador de gas helio | Bio-Rad | 165-2413 |
Referencias
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
