Ofrecemos un protocolo detallado para la preparación de las células primarias disociada de Drosophil A los embriones. La capacidad de llevar a cabo la efectiva perturbación RNAi, junto con otros métodos de imagen molecular, bioquímica y celular permite una variedad de cuestiones que deben abordarse en Drosophila Células primarias.
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Artículo de método
Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí se describe un método para la preparación y el cultivo de células primarias disociada de Drosophila embriones gástrula. En resumen, una gran cantidad de embriones de moscas de la escena joven y saludable son recolectados, esterilizados, y luego físicamente disocia en una suspensión de células individuales usando un homogeneizador de vidrio. Después de estar chapada en placas de cultivo o la cámara de diapositivas en una densidad adecuada en medio de cultivo, estas células pueden diferenciarse en más de varios tipos de células morfológicamente distintas, que pueden ser identificados por sus marcadores celulares específicos. Además, se presentan las condiciones para el tratamiento de estas células con doble cadena (ds) RNA para obtener caída de genes. Eficiente ARNi en células Drosophila primaria se logra simplemente impregnando las células en medio de cultivo que contienen dsRNA. La capacidad para llevar a cabo eficaz perturbación RNAi, junto con otros molecular, análisis bioquímicos, imágenes de células, que permiten una variedad de preguntas a ser respondidas en las células de Drosophila primaria, especialmente las relacionadas con musculares diferenciadas y las células neuronales.
Protocolo
1. Preparación de las jaulas de vuelo
- Crecer Drosophila (cepas de tipo salvaje como Oregon-R o cualquier genotipo) en envases convenientes tales como tazas de insectos 32-oz.
- Transferencia de las moscas recién eclosed a las grandes jaulas de recogida de embriones o volar jaulas población.
- Mover las jaulas en una habitación con una temperatura de ~ 25 ° C y la humedad ~ 65% en una luz de 12 horas y un oscuro ciclo de 12 horas para facilitar la recolección de los embriones sincrónica.
- Mantener a las moscas en las jaulas de la alimentación de ellos mató a pasta de levadura sembradas en placas de melaza. Cambiar las placa....
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Discusión
El patrón de desarrollo de los cultivos primarios de células de Drosophila puede variar mucho, posiblemente debido a las diversas variables durante el proceso de preparación de células primarias. En primer lugar, las moscas utilizadas para la puesta de huevos deben ser pequeños (menos de una semana de edad) y sanos (libres de la infección viral o bacteriana). Embriones fertilizados o infectado se debe evitar, ya que son inútiles, y las células derivadas de los embriones que no se puede diferenciar y sólo podrá .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
JB fue apoyada por el Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-02. JZ fue apoyado por el NIH / NIGMS F32 Fellowship GM082174-02. NP es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio Shields y Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Suero bovino fetal | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulina de páncreas bovino | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Jaulas grandes para recolección de embriones | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Criba de prueba estándar #25 de EE. UU. | VWR international | 57334-454 | |
| Criba de prueba estándar #45 de EE. UU. | VWR international | 57334-462 | |
| Criba de prueba estándar #120 de EE. UU. | VWR international | 57334-474 | |
| Molinillo de tejidos Dounce, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Molinillo de tejidos Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Molinillo de tejidos Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Placa Costar de 384 pocillos | VWR international | 29444-078 | |
| Cubrebocados con cámaras Lab-Tek II | Fisher Scientific | 171080 |
Referencias
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elong....
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Reimpresiones y permisos
