Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

Summary

Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.

Abstract

Replicación inexacta en la presencia de daño en el ADN es el responsable de la mayoría de los reordenamientos celulares y mutagénesis observado en todos los tipos celulares y se cree que estar directamente asociado con el desarrollo del cáncer en los seres humanos. Daños en el ADN, como la inducida por la radiación UV, que limita enormemente la capacidad de replicación de duplicar la plantilla de genómica precisa. Una serie de productos de los genes han sido identificados que son necesarios cuando se encuentra con la replicación de las lesiones del ADN en la plantilla. Sin embargo, un desafío pendiente ha sido la de determinar cómo estas lesiones proceso de las proteínas durante la replicación

Protocol

1. El crecimiento y la radiación ultravioleta.

1. 200μl de un cultivo fresco durante la noche que contiene el plásmido pBR322 crecido en medio de ^una Davis suplementado con 0,4% de glucosa, 0,2% casaminoácidos, y 10 mg / ml timina (medio DGCthy) y 100 ug / ml ampicilina es granulado. El pellet de células se resuspende entonces en un medio de DGCthy 200μl falta de ampicilina y se utiliza para inocular 20 ml de medio DGCthy.
2. Los cultivos son cultivados sin selección a la ampicilina en una incubadora de agitación a 37 ° C a una OD ₆₀₀ de 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ células / ml). Crecimiento sin ampicilina evita la selección contra....

Discussion

Los resultados típicos obtenidos a partir de células de tipo salvaje en presencia y ausencia de daño inducido por UV se muestra en la Figura 1. En la ausencia de daños, aproximadamente el 1% del ADN total de plásmido se puede encontrar en el arco Y cuando las células están creciendo rápidamente en la fase exponencial. Después de la irradiación, un aumento transitorio de las moléculas en forma de Y se observa como las horquillas de replicación bloqueadas se acumulan en los sitios dañados. Los intermediarios de replicació.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Un ejemplo del análisis del sur del gel 2D sondeado	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μ lámpara germicida de vatios	Sylvania	F20T12/GO	lámpara UV
Blak-Ray Medidor de intensidad UV 254nm	Daigger		EF28195T fotómetro UVC
0.025 μ m discos de poro	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Discos de diálisis flotantes
PvuII	Fermentas	ER0632	Endonucleasa de restricción Kit
de traducción de níquel	Grupo Roche	976776	Para hacer sonda marcada con 32P
Papel secante	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Para transferencia del sur
Membrana de nailon	GE Healthcare	RPN203S	Para la transferencia al sur