Name: Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a visualizar intermediarios de replicación del ADN en E. coli tras daño por UV mediante electroforesis en gel de agarosa bidimensional. Este método permite estudiar la respuesta celular al daño genético.

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El trabajo en nuestro laboratorio con el apoyo de Career Award MCB0551798 de la Fundación Nacional de Ciencia y AREA conceder R15GM86839 de la NIGMS-NIH.

1. El crecimiento y la radiación ultravioleta. <ol><li> 200μl de un cultivo fresco durante la noche que contiene el plásmido pBR322 crecido en medio de una Davis suplementado con 0,4% de glucosa, 0,2% casaminoácidos, y 10 mg / ml timina (medio DGCthy) y 100 ug / ml ampicilina es granulado. El pellet de células se resuspende entonces en un medio de DGCthy 200μl falta de ampicilina y se utiliza para inocular 20 ml de medio DGCthy. </li><li> Los cultivos son cultivados sin selección a la ampicilina en una incubadora de agitación a 37 ° C a una OD 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 células / ml). Crecimiento sin ampicilina evita la selección contra intermediarios de replicación anormal o improductivos que pueden surgir en algunos mutantes. Además, si se utiliza la luz ultravioleta para inducir daño, la eliminación de la ampicilina de los medios de comunicación es necesaria, ya que absorbe fuertemente en estas longitudes de onda y los escudos de las células, la reducción de la dosis efectiva de radiación UV. </li><li> Que trabajan bajo las luces amarillas, la cultura se encuentra en un diámetro de 15cm placa de Petri en una plataforma giratoria para la agitación. Nuestras culturas se colocan a una distancia de una lámpara de 15 vatios germicida que produce una tasa de exposición de aproximadamente 1 J/m2/sec, que se mide con un fotómetro de UVC. Las culturas son irradiados con 50 J/m2 y luego se coloca inmediatamente detrás en el temblor 37 ° C incubadora para la duración del experimento. Esta dosis produce, en promedio, un ciclobutano pirimidina dímero cada 4,5 kb de ADN de cadena simple. La iluminación amarilla impide fotorreactivación-inversión de los dímeros de pirimidina ciclobutano por fotoliasa. </li></ol> 2. De aislamiento de ADN. <ol><li> En momentos en que los intermediarios de replicación se han de examinar, una alícuota de 0,75 ml de la cultura se coloca en 0,75 ml de hielo frío NET30 buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) y se coloca en hielo hasta el final de el transcurso del tiempo. Por lo general un curso de 90 minutos, con muestras examinadas a los 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos. El EDTA y la temperatura fría sirven para detener efectivamente la replicación y la reparación por escisión de nucleótidos. </li><li> Cada muestra se sedimentaron, se resuspendieron en 150 ml de 1,5 mg / ml de lisozima y 0,2 mg / ml RNAseA en TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), y lisadas a 37 ° C durante 20 min. En este tiempo, 10μl de proteinasa K (10mg/ml) y 10μl de 20% sarkosyl se añadió la incubación se permite que continúe durante 1 hora. Proteinasa K y sarkosyl ayudan a liberar fragmentos de ADN que pueden estar asociados con la membrana o las proteínas antes de la extracción con fenol se produce. Dado que el ADN en replicación activa es a menudo obligados a complejos de proteínas o de la membrana, esto ayuda a aumentar el rendimiento de la replicación de los fragmentos que han sido recuperadas. </li><li> Las muestras se extraen mediante la adición de 2 volúmenes de fenol para cada muestra y los tubos se vuelve a invertir durante 5 minutos. A continuación, dos volúmenes de cloroformo / alcohol isoamílico (24 / 1) se agregan y los tubos se vuelve a invertir de nuevo durante 5 minutos. </li><li> Las muestras se centrifugan a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 minutos y la fase superior acuosa de cada muestra se retira y se coloca en un tubo nuevo. A continuación, cuatro volúmenes de cloroformo / alcohol isoamílico (24 / 1) se añaden, los tubos se vuelve a invertir durante 5 minutos y se centrifuga de nuevo a 14.000 rpm durante 5 minutos. </li><li> La fase superior acuosa, en cada muestra se dializa durante 1 hora en manchas 100μl de cada muestra en un disco de 47 mm Whatman 0.025 micras de poro que flota en 250 ml de 0,1 X TE en un vaso. Porque las estructuras de replica con las regiones solo filamento o puntos de ramificación son más susceptibles al corte, por lo general reducir nuestras puntas de pipeta con una hoja de afeitar para hacer la boca más ancha y reducir al mínimo las fuerzas de cizallamiento. En general, las pipetas deben mantenerse al mínimo hasta que el ADN ha sido digerido con enzimas de restricción. </li><li> Cada muestra se digiere con PvuII (New England Biolabs), que alinea el plásmido justo abajo de el origen de replicación. </li><li> Antes de la carga en el gel de agarosa, el cloroformo y 100μl 20μl de colorante de carga 6X que contiene cyanol azul de bromofenol y xileno se añadió a cada muestra y se mezcla. Entonces, 40μl de la fase acuosa que contiene el colorante de carga se carga en el gel. Para minimizar los sesgos estructurales, artefactos estructurales, y cortar el ADN, el procedimiento de aislamiento no incluye ninguna medida para enriquecer a las regiones sola hebra, precipitado, o concentrar las muestras de ADN después de la lisis celular. </li></ol> 3. Gel 2D y Análisis del Sur. <ol><li> El 2-dimensional de agarosa-gel análisis se ha modificado a partir del 3. Para la 1 ª dimensión, las muestras de ADN restringido se ejecutan a través de un gel de agarosa 0,4% en TBE 1X en 1V/cm. Un litro de solución 10X TBE contiene acciones: <ul><li> 108 g de Tris Base </li><li> 55 g de ácido bórico </li><li> 40 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0) </li></ul></li><li> A lambda posteriores marcador de tamaño III se carga en el primer carril, las muestras se cargan en cada carril. Por lo general ejecuta la primera dIMENSIÓN ~ 15.12 hrs. Saltarse los carriles es más fácil de cortar las rutas a lanzar en la segunda dimensión. El bajo voltaje y baja por ciento en gel de agarosa sirve para separar los fragmentos de ADN sobre todo en función del tamaño. </li><li> Para la segunda dimensión, carriles de gel se cortan fuera de la primera dimensión de gel con un cuchillo de carnicero de grandes. El primer carril que contiene el marcador lambda HindIII se puede teñir con bromuro de etidio. Con el marcador lambda HindIII como guía, cortar y desechar la región del gel que se encuentra por debajo en el plásmido linealizado se espera que funcione. En estas condiciones, nos encontramos con que pBR322 linearizado encuentra ligeramente por encima de la mancha cyanol xileno. </li><li> Para lanzar la segunda dimensión, cada carril se coloca horizontalmente en la parte superior de un lanzador de gel vacías. Una solución de 1,0% de agarosa en TBE 1X se prepara y se enfría a 55 ° C. En este momento, la solución de gel se vierte en el molde para la segunda dimensión, asegurándose de cubrir completamente las rodajas de gel. Una vez que el gel se ha puesto, que se ejecuta en 6.5V/cm en una unidad de electroforesis, que permite la recirculación de la memoria intermedia. Nosotros normalmente se ejecuta la segunda dimensión ~ 5.5-7 horas. El alto voltaje y alta por ciento en gel de agarosa separa eficazmente los fragmentos de ADN en base a su forma, así como el tamaño. Formas no lineales se ejecutan más lentamente a través de la segunda dimensión. </li><li> Tras la electroforesis, el gel se enjuaga en H 2 O, se lavaron dos veces en 400 ml de ácido clorhídrico 0,25 M durante 15 minutos, se lavan con H 2 O;, y luego se lavan dos veces en 400 ml de NaOH 0,4 M durante 30 minutos. El ácido se lava sirven para nick parcialmente las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños que la transferencia más eficiente. Este paso es necesario debido al gran tamaño y formas poco comunes de los intermediarios de replicación del ADN. </li><li> El ADN de los geles se transfiere entonces a un Hybond N + membrana de nylon 4. Usamos un sistema de baja transferencia de álcali con 0,4 M NaOH. En resumen, dos hojas de papel secante empapado en 0,4 M de NaOH se colocan en una gran pila de toallas de papel. La membrana de nylon también empapado en 0,4 M de NaOH y se coloca en la parte superior del papel secante. El gel es cuidadosamente por capas en la parte superior de este, seguido de otro pedazo de papel secante, mojada en la solución de NaOH. Por último, una larga pieza de papel secante mojado es en capas en la parte superior y sus dos extremos se colocan en una vajilla que contiene 1 L de solución de NaOH 0,4 M para servir como una mecha. Por lo general permiten la transferencia de ADN de 6-12 hrs. </li><li> La membrana de nylon, se lava 20-30 segundos en Buffer 5X SSC, y se coloca en una botella de rodillos de hibridación que contenía solución de prehibridación 10.5ml. A continuación, la membrana se incuba a 42 ° C con rotación por más de 6 horas. Prehibridación solución: <ul><li> 5,0 ml de formamida </li><li> 0,5 ml de 20% SDS </li><li> 2,5 ml de 20X SSC * </li><li> * 2.0 ml 50X Denhardt </li><li> 0,5 ml de esperma de salmón de ADN (10mg/ml) * Recetas para la CSS y de Denhardt se puede encontrar en cinco </li></ul></li><li> Durante el período de prehibridación, 1 g de plásmido pBR322 es marcado con 32P por nick de traducción de acuerdo con el protocolo suministrado por Roche con la etiqueta alfa [32 P]-dCTP. La sonda marcada radiactivamente (100μl) se desnaturaliza mediante la incubación a 98 ° C durante 10 minutos en un tubo de microcentrífuga de tornillo de la tapa y se coloca inmediatamente en hielo. </li><li> La sonda desnaturalizada se añade 5,9 ml de solución de hibridación, que contiene: <ul><li> 3,0 ml de formamida </li><li> 1,5 ml de SSC </li><li> 1,0 ml de H 2 O </li><li> 0,15 ml 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml de 20% SDS </li><li> 0,15 ml de esperma de salmón 10mg/ml ADN </li></ul></li><li> La solución de prehibridación se derrama de la botella de rodillo y la solución de hibridación se vierte pulg La botella de rodillos se devuelve a los 42 ° C incubadora y se gira desde hace más de 12 horas. </li><li> La solución de hibridación se derrama de la botella de rodillo. Entonces, la mancha se lavaron 4 veces durante 20 minutos en la botella de rodillos con ~ 150 ml de una solución de lavado que contiene 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 42 ° C con rotación. </li><li> Tras el último lavado, la membrana se coloca sobre una toalla de papel hasta que el líquido ha desaparecido visiblemente. La membrana se envuelve en papel de plástico de polivinilo de cloruro y se expone a una pantalla phosphorimager. Nos visualizar y cuantificar la radiactividad con una tormenta de 840 y su software asociado ImageQuant. </li></ol> 4. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Intermediarios de replicación del plásmido observada en la presencia y ausencia de daño en el ADN inducido por UV. El patrón de migración de PvuII digerido plásmido pBR322 observado por 2D-gel de agarosa-análisis es un diagrama. No repetición de los plásmidos lineales se ejecute como un lineal de 4,4 kb fragmento. Plásmidos replicar la forma en forma de Y las estructuras que migran más lentamente que los fragmentos no replican debido a su mayor tamaño y noforma nlinear. Este patrón de migración en forma de arco que se extiende desde la región lineal hacia el pozo. Después de la irradiación UV, doble-Y o moléculas en forma de X se observan en la región del cono que se desplaza más lentamente que el arco en forma de Y de las moléculas. Un ejemplo del análisis de Southern del gel 2D probaron con marcado con 32P pBR322 se muestra de las células inmediatamente después de la irradiación UV y 15 minutos después de la irradiación UV (reproducido con permiso del editor).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Los resultados típicos obtenidos a partir de células de tipo salvaje en presencia y ausencia de daño inducido por UV se muestra en la Figura 1. En la ausencia de daños, aproximadamente el 1% del ADN total de plásmido se puede encontrar en el arco Y cuando las células están creciendo rápidamente en la fase exponencial. Después de la irradiación, un aumento transitorio de las moléculas en forma de Y se observa como las horquillas de replicación bloqueadas se acumulan en los sitios dañados. Los intermediarios de replicació...

<table><tbody><tr><td>Un ejemplo del análisis Southern en gel 2D sonda</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Iluminación amarilla</td></tr><tr><td>Lámpara germicida de 15 &amp;mu;watt</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>Lámpara UV</td></tr><tr><td>Medidor de intensidad UV Blak-Ray 254 nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>Fotómetro UVC</td></tr><tr><td>Discos de poro de 0,025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Discos de diálisis flotantes</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Endonucleasa de restricción</td></tr><tr><td>Kit de traducción con mella</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Para hacer sonda marcada con 32P</td></tr><tr><td>Papel para transferencia</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Para transferencia Southern</td></tr><tr><td>Membrana de nailon</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Para transferencia Southern</td></tr></tbody></table>

visualización de intermediarios de replicación inducidos por uv en e. coli con dos dimensiones-gel de agarosa análisis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Replicación inexacta en la presencia de daño en el ADN es el responsable de la mayoría de los reordenamientos celulares y mutagénesis observado en todos los tipos celulares y se cree que estar directamente asociado con el desarrollo del cáncer en los seres humanos. Daños en el ADN, como la inducida por la radiación UV, que limita enormemente la capacidad de replicación de duplicar la plantilla de genómica precisa. Una serie de productos de los genes han sido identificados que son necesarios cuando se encuentra con la replicación de las lesiones del ADN en la plantilla. Sin embargo, un desafío pendiente ha sido la de determinar cómo estas lesiones proceso de las proteínas durante la replicación<em&gt; In vivo</em&gt;. Usando Escherichia coli como un modelo de sistema, se describe un procedimiento en el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar los intermedios estructurales que surgen en los plásmidos replicar<em&gt; In vivo</em&gt; Después de la radiación UV-inducida por daño en el ADN. Este procedimiento se ha utilizado para demostrar que las horquillas de replicación bloqueadas por el daño inducido por UV someten a una reversión transitoria que se estabiliza por Reca y varios productos de genes asociados con la vía RecF. La técnica demuestra que estos intermediarios de replicación se mantienen hasta el momento que se correlaciona con la eliminación de las lesiones de reparación por escisión de nucleótidos y se reanuda la replicación.

Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.

Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

La replicación inexacta en presencia de daño en el ADN es responsable de la mayoría de los reordenamientos celulares y la mutagénesis observados en todos los tipos celulares...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los intermediarios estructurales del ADN que se producen cuando la replicación encuentra lesiones en el ADN, mediante el uso de un análisis en gel bidimensional. Esto se logra primero aislado el ADN de células en división activa en las cuales se han inducido lesiones que bloquean la replicación. Luego, se utiliza la electroforesis en gel para separar el ADN recuperado según su tamaño. A continuación, se cortan las bandas y se recolocan horizontalmente en un segundo gel que separa aún más el ADN según su tamaño y forma. Finalmente, se utiliza el análisis Southern para visualizar las estructuras de ADN asociadas con fragmentos de ADN en replicación en momentos anteriores y en diversos momentos posteriores a la introducción de daños inducidos por UV. En última instancia, este procedimiento puede utilizarse para demostrar que la incapacidad de procesar lesiones en el ADN en ciertos mutantes provoca la acumulación de intermediarios de reparación del ADN.Hola, mi nombre es Arthur Ian. Soy del Laboratorio Corella de la Universidad Estatal de Portland. Hola, mi nombre es Brand she, yo también soy del Laboratorio Corella.Hoy les mostraremos un procedimiento para la electroforesis en gel bidimensional. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los intermediarios de la replicación y reparación del ADN. Así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, cultive una cultura sobrenocturna de 200 microlitros de e coli que contenga el plásmido PBR 3 22 en medio DGC thigh con ampicilina a 37 grados Celsius. El uso del medio DGC thigh minimiza la protección contra la UV. Tras la incubación sobrenocturna, pelletice las células a 14,000 RRP M durante 30 segundos.Luego, resuspenda el sedimento celular en 200 microlitros de medio DG C th sin ampicilina e inocule. Cultive 20 mililitros de medio DG C th sin selección con ampicilina. Incube en un incubador con agitación a 37 grados Celsius hasta alcanzar una DO600 de 0,5, lo que corresponde aproximadamente a cinco veces 10 a la octava células por mililitro. El crecimiento sin ampicilina evita la selección en contra de intermediarios de replicación anormales o no productivos que podrían surgir en algunos mutantes.Además, si se utiliza luz UV para inducir daño, es necesario eliminar la ampicilina del medio porque absorbe fuertemente a estas longitudes de onda y actúa como escudo, reduciendo la dosis efectiva de UV mientras las células crecen. Utilice un fotómetro UVC para determinar la distancia desde una lámpara germicida de 15 vatios que produzca una tasa de exposición de aproximadamente un JUUL por metro cuadrado por segundo.Los pasos subsiguientes deben realizarse bajo luz amarilla, ya que esto evitará la reversión por fotoactivación de los dímeros de ciclobutano en las bases pirimídicas mediante la fotoliasa después de la irradiación con UV. Una vez alcanzada la densidad celular deseada, utilice una pipeta para transferir el cultivo a una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro colocada sobre una plataforma rotatoria, con el fin de asegurar una irradiación uniforme de toda la población celular. A continuación, irradie los cultivos con 50 joules por metro cuadrado e inmediatamente transfiéralos a un matraz estéril previamente calentado y colóquelos de nuevo en el incubador a 37 grados Celsius con agitación.Durante toda la duración del experimento, esta dosis produce en promedio un dímero de ciclobutano por cada 4,5 kilobases de ADN de cadena sencilla, por cada punto temporal que se vaya a examinar. Pipetee un alícuota de 0,75 mililitros de la cultura en 0,75 mililitros de NET 30 frío con hielo. El tampón NET 30 sirve como tampón de parada que impide que continúen la replicación y la reparación por escisión de nucleótidos.Una vez que se haya agregado el tampón de parada, la muestra puede mantenerse en hielo hasta el final del curso temporal. Después del curso temporal, centrifugue cada muestra y resuspenda los pellets. En 150 microlitros de tampón de lisis, lise las células a 37 grados Celsius durante 20 minutos sin agitación.Dado que las estructuras replicativas con regiones de cadena sencilla o puntos de ramificación son más susceptibles al cizallamiento, corte las puntas de las pipetas con una cuchilla de afeitar para agrandar la boca y minimizar las fuerzas de cizallamiento. En general, se debe mantener al mínimo la pipetación y la agitación hasta después de que el ADN haya sido digerido con enzimas de restricción; tras la lisis, agregue proteinasa K y célula sarcosina y permita que la incubación continúe durante una hora. Esto sirve para liberar fragmentos de ADN asociados con proteínas.Dado que el ADN en replicación activa a menudo se encuentra unido a complejos de proteínas o membranas, esto ayuda a aumentar el rendimiento de los fragmentos de replicación. Después de una hora, extraiga las muestras añadiendo dos volúmenes de fenol a cada muestra e invirtiendo suavemente los tubos durante cinco minutos. A continuación, añada dos volúmenes de cloroformo, alcohol isoamílico, e invierta suavemente los tubos durante cinco minutos adicionales.A continuación, centrifugue las muestras a 14.000 RPM en una microcentrífuga durante cinco minutos y transfiera la fase acuosa superior de cada muestra a un tubo nuevo. Luego agregue cuatro volúmenes de alcohol ISO con cloroformo e invierta suavemente los tubos durante cinco minutos. Vuelva a centrifugar las muestras a 14.000 RPM durante cinco minutos.Coloque una membrana de diálisis sobre 250 mililitros de 0,1 xte en un vaso de precipitados y aplique 100 microlitros de cada muestra sobre la membrana. Deje que las muestras se dialicen durante una hora tras la diálisis. Coloque 80 microlitros de cada muestra en un tubo fresco de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de mezcla enzimática.Digiera las muestras durante la noche a 37 grados Celsius. PV dos linealiza el plásmido justo aguas abajo del origen de replicación. Antes de cargar el gel de agarosa, agregue 100 microlitros de cloroformo y 20 microlitros de colorante de carga seis x que contiene bromo.Fenol azul y xileno cianol a cada muestra y mezcle cloroformo eliminará cualquier PV dos restante unido a los extremos del ADN. Comience el análisis en gel de agarosa bidimensional realizando la corrida de las muestras de ADN digeridas a través de la primera dimensión. Primero cargue un marcador de tamaño Lambda Hind tres en la primera hendidura de un gel de agarosa 0,4 % previamente preparado en 1X TBE.Luego cargue 40 microlitros de la fase acuosa que contiene el colorante de carga para cada muestra, omitiendo pozos para facilitar el corte del gel. Tras la electroforesis, realice la primera dimensión a un voltio por centímetro durante aproximadamente 12 a 15 horas. El voltaje bajo y el gel de AGROS de bajo porcentaje sirven para separar los fragmentos de ADN principalmente según su tamaño.Después de que haya corrido la primera dimensión, utilice un cuchillo grande de carnicero para recortar la primera banda que contiene el marcador Lambda Hind III y tiña con bromuro de etidio. Para la segunda dimensión, corte las bandas del gel usando el cuchillo grande de carnicero y el marcador Lambda Hind III como guía de corte, y deseche la región inferior donde se espera que migre el plásmido linealizado en cada banda. Para moldear la segunda dimensión, coloque cada trozo horizontalmente a lo largo del borde superior de un molde para geles vacío.Prepare una solución de 1 % AROS en un XTBE y enfríe a 55 grados Celsius. Una vez enfriada, vierta la solución de gel para verter la segunda dimensión, asegurándose de cubrir completamente las rebanadas de gel. Es importante garantizar que las rebanadas estén orientadas uniformemente y que el molde esté nivelado antes de verter el gel.Una vez que el gel haya solidificado, realice la segunda dimensión durante cinco horas y media a siete horas a 6,5 volúmenes por centímetro en una unidad de electroforesis que permita la recirculación del tampón; el gel de agarosa de alto voltaje y alto porcentaje separa eficazmente los fragmentos de ADN según su forma y también según su tamaño. Las formas no lineales migran más lentamente a través de la segunda dimensión tras la electroforesis. Enjuague el gel una vez con agua y luego lávelo dos veces en 400 mililitros de ácido clorhídrico 0,25 molar durante 15 minutos con agitación suave.Los lavados ácidos sirven para romper parcialmente las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños que se transfieren de manera más eficiente durante el análisis southern, y son necesarios debido al gran tamaño y la forma inusual de los intermediarios de la replicación del ADN. Para preparar el gel para la transferencia alcalina, enjuague nuevamente el gel con agua y luego lávelo dos veces en 400 mililitros de hidróxido de sodio 0,4 molar durante 30 minutos. El ADN presente en los geles se transfiere entonces a una membrana de nylon de alto enlace n plus mediante un sistema de transferencia alcalina descendente con hidróxido de sodio 0,4 molar, como se describe en la parte escrita de este procedimiento; permita que la transferencia del ADN continúe durante seis a doce horas. Tras la transferencia del ADN, continúe con la hibridación de la sonda según lo indicado en el protocolo escrito.Una vez que la membrana haya sido incubada con la sonda y lavada, coloque la membrana sobre una toalla de papel hasta que el líquido haya desaparecido visiblemente. A continuación, envuelva la membrana en una envoltura de plástico de cloruro de polivinilo y expóngala a una pantalla de imagen fosforescente. Finalmente, la radiactividad puede visualizarse y cuantificarse utilizando un Storm 840 y su software de cuantificación de imágenes asociado.Se diagrama el patrón de migración de la PV dos del plásmido PBR 3 22 digerido observado mediante análisis en gel de arcos 2D. Los plásmidos lineales no replicantes se desplazan como un fragmento lineal de 4,4 KB; los plásmidos replicantes forman estructuras en forma de Y que migran más lentamente que los fragmentos no replicantes debido a su mayor tamaño y forma no lineal. Este patrón de migración forma un arco que se extiende desde la región lineal hacia el pozo tras la irradiación con UV.Se observan moléculas con forma de doble Y o X en la región del cono y migran más lentamente que el arco de moléculas con forma de Y. Se muestra un ejemplo del análisis southern en geles 2D sonda con PBR 32 marcado con P 32 en células inmediatamente después de la irradiación con UV y a los 15 minutos posteriores a la irradiación con UV inmediatamente después de la irradiación con UV. Aproximadamente el 1 % del ADN plasmático total puede encontrarse en el arco de Y cuando las células crecen rápidamente en fase exponencial tras una radiación.Se observa un aumento transitorio de moléculas en forma de YS cuando se acumulan horquillas de replicación bloqueadas en sitios dañados. Los intermediarios de replicación en forma de L también se acumulan temporalmente y persisten hasta un momento que se correlaciona con la reparación de las lesiones. Acabamos de mostrarle cómo visualizar intermediarios de reparación del ADN utilizando electroforesis en gel bidimensional.Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta las fuerzas de cizallamiento que pueden reducir el rendimiento y tratar con delicadeza todas las muestras y geles. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Fuente: Cayron, J. y Lesterlin, C. Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para evaluar la filamentación de E. coli y la replicación del ADN bajo tratamiento con antibióticos inhibidores de la división celular utilizando placas para medir la viabilidad y citometría de flujo para analizar el tamaño de la célula y el contenido de ADN.

Evaluación de la filamentación inducida por antibióticos en E. coli mediante ensayo de placa y citometría de flujo

Fuente: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induciendo una obstrucción de replicación específica en sitio en E. coli usando un sistema operador de represor fluorescente. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra la obstrucción específica del yacimiento de replicación en Escherichia coli utilizando la expresión inducida por arabinosa de TetR marcado con proteínas fluorescentes amarillas que se une a las matrices cromosómicas de tetO.

Bloqueo de replicación mediado por proteínas represoras marcadas fluorescentemente en Escherichia coli

Fuente: Bratton, B. P., et al., Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el método para adquirir y analizar imágenes de fluorescencia tridimensionales de células bacterianas para estudiar la organización de proteínas a nivel de célula única.

Visualización de la distribución de proteínas bacterianas en tres dimensiones mediante imagen de fluorescencia

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Aprende a visualizar intermediarios de replicación del ADN en E. coli tras daño por UV mediante electroforesis en gel de agarosa bidimensional. Este método permite estudiar la respuesta celular al daño genético.

Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

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