Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los intermedios estructurales del ADN que se producen cuando la replicación se encuentra con lesiones de ADN mediante un análisis de gel bidimensional. Esto se logra aislando primero el ADN de las células que se dividen activamente en las que se han inducido lesiones que bloquean la replicación. A continuación, se utiliza la electroforesis en gel para separar el ADN recuperado en función del tamaño.

A continuación, los carriles se recortan y se vuelven a fundir horizontalmente en un segundo gel que separa aún más el ADN en función del tamaño y la forma. Finalmente, el análisis del sur se utiliza para visualizar las estructuras de ADN que están asociadas con la replicación de fragmentos de ADN en momentos antes y en varios momentos después de la introducción del daño inducido por los rayos UV. En última instancia, este procedimiento se puede utilizar para demostrar que la incapacidad de procesar las lesiones del ADN en ciertos mutantes da lugar a la acumulación de intermediarios de reparación del ADN.

Hola, mi nombre es Arthur Ian. Vengo del Laboratorio Corella de la Universidad Estatal de Portland. Hola, mi nombre es Brand ella, también soy del Laboratorio Corella.

Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para la electroforesis en gel bidimensional. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la replicación del ADN y reparar intermediarios. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive un cultivo nocturno de 200 microlitros de E. coli que contenga el plásmido PBR 3 22 en medio de muslo DGC con ampicilina a 37 grados Celsius. El uso de medio para muslos DGC minimiza la protección contra los rayos UV. Después de la incubación durante la noche, pegue las células a 14.000 PVP M durante 30 segundos.

A continuación, resuspender el pellet celular en 200 microlitros de DG C th medio sin ampicilina e inocular. 20 mililitros de medio de muslo DG C cultivan cultivos sin selección de ampicilina. En una incubadora agitada a 37 grados centígrados a un OD 600 de 0,5, que corresponde a unas cinco veces 10 a la octava celdas, el crecimiento por mililitro sin ampicilina evita la selección frente a intermediarios de replicación anormales o improductivos que pueden surgir en algunos mutantes.

Además, si se utiliza luz ultravioleta para inducir daño, es necesario eliminar la ampicilina del medio porque absorbe fuertemente en estas longitudes de onda y protege. Las células reducen la dosis efectiva de UV mientras las células están creciendo. Utilice un fotómetro UVC para determinar la distancia de una lámpara germicida de 15 vatios que produce una tasa de exposición de aproximadamente un JUUL por metro cuadrado por segundo.

Los pasos posteriores deben realizarse bajo luz amarilla, ya que esto evitará la reactivación de la fotoactivación de los dímeros perinales de ciclobutano mediante fotoliase después de la irradiación UV. Una vez alcanzada la densidad celular deseada, utilice una pipeta para transferir el cultivo a una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro en una plataforma giratoria para garantizar una irradiación uniforme de toda la población celular. A continuación, irradie los cultivos con 50 julios por metro cuadrado y transfiéralos inmediatamente a un matraz precalentado estéril y colóquelos de nuevo en la incubadora agitada a 37 grados centígrados.

Durante la duración del experimento, esta dosis produce en promedio un dímero de ciclobutano perine, cada 4,5 kilobases de ADN monocatenario por cada punto de tiempo que se va a examinar. Pipetear una alícuota de 0,75 mililitros del cultivo en 0,75 mililitros de hielo neto 30. La red de tampón 30 sirve como un tampón de parada que evita que la replicación y la reparación de la escisión de nucleótidos continúen.

Una vez que se ha agregado el tampón de parada, la muestra se puede mantener en hielo hasta el final del curso de tiempo. Pasado el tiempo de curso de pellets cada muestra y resuspender los pellets. En 150 microlitros de tampón de lisis, lije las células a 37 grados centígrados durante 20 minutos sin agitación.

Debido a que las estructuras replicantes con regiones de una sola hebra o puntos de ramificación son más susceptibles al cizallamiento, corte las puntas de las pipetas con una cuchilla de afeitar para ensanchar la boca y minimizar las fuerzas de cizallamiento. En general, el pipeteo y la agitación deben mantenerse al mínimo hasta después de que el ADN haya sido digerido con enzimas de restricción, después de la lisis, agregar proteinasa K y célula sarcas y permitir que la incubación continúe durante una hora. Esto sirve para liberar fragmentos de ADN asociados con la proteína.

Dado que el ADN que se replica activamente a menudo se une a proteínas o complejos de membrana, esto ayuda a aumentar el rendimiento de los fragmentos de replicación. Después de una hora, extraiga las muestras agregando dos volúmenes de fenol a cada muestra e invirtiendo suavemente los tubos durante cinco minutos. A continuación, añada dos volúmenes de cloroformo, isoamilo, alcohol e invierta suavemente los tubos durante cinco minutos más.

A continuación, centrifugar las muestras a 14.000 RPM en una microcentrífuga durante cinco minutos y transferir la fase acuosa superior de cada muestra a un tubo nuevo. A continuación, añada cuatro volúmenes de cloroformo alcohol ISO y, de nuevo, invierta suavemente los tubos durante cinco minutos. Centrifugar las muestras de nuevo a 14.000 rpm durante cinco minutos.

Coloque una membrana de diálisis encima de 250 mililitros de 0,1 xte en un vaso de precipitados y coloque 100 microlitros de cada muestra en la membrana. Deje que las muestras se dialicen durante una hora después de la diálisis. Coloque 80 microlitros de cada muestra en un tubo nuevo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de mezcla de enzimas.

Digiera las muestras durante la noche a 37 grados centígrados. PV dos linealiza el plásmido justo aguas abajo del origen de la replicación. Antes de cargar el gel agros, agregue 100 microlitros de cloroformo y 20 microlitros de seis tintes de carga que contengan bromo.

El azul de fenol y el xileno cian en cada muestra y mezcla de cloroformo eliminarán cualquier PV restante unido a dos extremos del ADN. Comience el análisis bidimensional de gel de aros ejecutando las muestras de ADN restringidas a través de la primera dimensión. Primero cargue un marcador Lambda trasero de tres tamaños en el primer carril de un gel 0.4%agros previamente preparado en un XTBE.

A continuación, cargue 40 microlitros de la fase acuosa que contiene el colorante de carga para cada muestra, saltándose carriles para facilitar el corte en gel. Después de la electroforesis, haga funcionar la primera dimensión a un voltio por centímetro durante aproximadamente 12 a 15 horas. El gel AGROS de bajo voltaje y bajo porcentaje sirve para separar los fragmentos de ADN principalmente en función del tamaño.

Después de que se haya ejecutado la primera dimensión, use un cuchillo de carnicero grande para cortar el primer carril que contiene el marcador de tres traseros Lambda y manche con bromuro de aterio. Para la segunda dimensión, corte los carriles de gel con el cuchillo de carnicero grande usando el marcador Lambda Hind tres como cultivo guía y descarte la región debajo de donde se espera que corra el plásmido linealizado en cada carril. Para lanzar la segunda dimensión, coloque cada corte horizontalmente en la parte superior de un rodillo de gel vacío.

Prepare una solución de 1%AROS en un XTBE y enfríe a 55 grados centígrados. Una vez enfriado, vierta la solución de gel para moldear la segunda dimensión, asegurándose de cubrir completamente las rodajas de gel. Es importante asegurarse de que las rodajas estén orientadas uniformemente y que la rueda esté nivelada antes de verter el gel.

Una vez que el gel se haya fraguado, haga funcionar la segunda dimensión, de cinco horas y media a siete horas a 6,5 volúmenes, por centímetro, en una unidad de electroforesis que permita que el tampón recircule el gel Agros de alto voltaje y alto porcentaje para separar eficazmente los fragmentos de ADN en función de su forma y su tamaño. Las formas no lineales corren más lentamente a través de la segunda dimensión después de la electroforesis. Enjuague el gel con agua una vez y luego lávelo dos veces en 400 mililitros de ácido clorhídrico 0,25 molar durante 15 minutos con agitación suave.

Los lavados ácidos sirven para cortar parcialmente las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños que se transfieren de manera más eficiente durante el análisis del sur y son necesarios debido al gran tamaño y la forma inusual de los intermediarios de replicación del ADN. Para preparar el gel para la transferencia de álcalis, enjuague el gel nuevamente con agua, luego lávelo dos veces en 400 mililitros de hidróxido de sodio 0,4 molar durante 30 minutos. Luego, el ADN en los geles se transfiere a una membrana de nailon de alta unión n plus utilizando un sistema de transferencia de álcali descendente con hidróxido de sodio 0.4 molar como se describe en la parte escrita de este procedimiento, deje que la transferencia de ADN durante seis a 12 horas después de la transferencia de ADN continúe con la hibridación de la sonda como se describe en el protocolo escrito.

Una vez que se haya sondeado y lavado la membrana, colóquela sobre una toalla de papel hasta que el líquido haya desaparecido visiblemente. A continuación, envuelva la membrana en una envoltura de plástico de cloruro de polivinilo y expóngala a una pantalla de generador de imágenes de fósforo. Por último, la radiactividad puede visualizarse y cuantificarse utilizando una tormenta 8 40 y su cuanto de imagen asociado.

Se diagrama el patrón de migración de dos plásmidos PBR 3 22 digeridos por PV dos blastomas observado por el análisis en gel de aros 2D. Los plásmidos lineales no replicantes se ejecutan como estructuras lineales en forma de plásmido de 4,4 KB que replican plásmidos en forma de Y que migran más lentamente que los fragmentos no replicantes debido a su mayor tamaño y forma no lineal. Este patrón de migración forma un arco que se extiende desde la región lineal hacia el pozo después de la irradiación UV.

Las moléculas dobles en forma de Y o X se observan en la región del cono y migran más lentamente que el arco de moléculas en forma de Y. Un ejemplo del análisis del sur del gel 2D sondeado con P 32 marcado con PBR 3 22 se muestra para las células inmediatamente después de la irradiación UV y 15 minutos después de la irradiación UV inmediatamente después de la irradiación UV. Aproximadamente el 1% del ADN plasmático total se puede encontrar en el arco Y cuando las células crecen rápidamente en fase exponencial después de una radiación.

Se observa un aumento transitorio de las moléculas en forma de YS a medida que las horquillas de replicación bloqueadas se acumulan en los sitios dañados. Los intermedios de replicación en forma de L también transitorios, se acumulan y persisten hasta un momento que se correlaciona con el momento en que se reparan las lesiones. Acabamos de mostrarle cómo visualizar los intermediarios de reparación del ADN mediante electroforesis en gel bidimensional.

Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta las fuerzas de cizallamiento que pueden reducir el rendimiento y ser cuidadoso con todas las muestras y geles. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.