Este protocolo describe un método no viral de la entrega de las construcciones genéticas en un área determinada del cerebro de roedor viviente. El método consiste en la preparación de plásmidos, fabricación micropipeta, la cirugía de las crías de rata neonatal, la microinyección de la construcción, y In vivo Electroporación.
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Artículo de método
Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación
En este artículo
Resumen
Resumen
La creación de animales transgénicos es un método estándar en el estudio de las funciones de un gen de interés en vivo. Sin embargo, muchos nocaut o animales transgénicos no son viables en los casos en que se expresa el gen modificado o suprimido en todo el organismo. Por otra parte, una variedad de mecanismos de compensación a menudo hacen difícil interpretar los resultados. Los efectos de compensación puede ser aliviado por tanto tiempo la expresión del gen o limitar la cantidad de células transfectadas.
El método de post-natal no ventricular microinyección y electroporación in vivo permite la ejecución selectiva de los genes, o siRNA moléculas de colorante directamente a una pequeña región de interés en el cerebro de roedores recién nacidos. En contraste con la técnica convencional de inyección ventricular, este método permite la transfección de los tipos de células no migratorias. Animales transfectadas mediante el método descrito aquí puede ser usado, por ejemplo, de dos fotones de imágenes in vivo o en experimentos electrofisiológicos en rebanadas de cerebro agudo.
Protocolo
1. Introducción
La creación de animales transgénicos es un poderoso método de investigación de las funciones de genes en animales vivos y un mecanismo para desentrañar la enfermedad de 2,3, así como para la manipulación de las propiedades de las células 4. Sin embargo, el procedimiento es bastante laboriosa, extremadamente largo y costoso, por lo que justifica el uso de métodos alternativos de entrega de genes virales como la inyección de 5, la inyección ventricular neonatal con la electroporación 6 y en el útero de la electroporación 7,8. El método de post-natal no ....
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Discusión
Métodos de administración de genes en el cerebro de los roedores que viven están bien establecidos en el útero de la electroporación 7,8,11,12 y, más recientemente, para la electroporación postnatal 6. Sin embargo, estos métodos se basan en la inyección intraventricular de ADN plásmido, que puede ser limitante para varias aplicaciones. Por ejemplo, estos métodos no permiten atacar a las células en ciertas áreas cerebrales como el hipocampo, ni la transfección de estos tipos de células no m.......
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Agradecimientos
Damos las gracias a Ekaterina Karelina para ayudar con la grabación de la banda sonora para el vídeo, Ivan Molotkov de animación en 3D y el Dr. Peter Blaesse de CAG-EGFP preparación de plásmidos.
El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Fundación Cultural de Finlandia y la Academia de Finlandia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzas 2A-sa dumb, 115 mm | equipo | XYtronic | XY-2A-SA | Tratar con etanol al 70 % para desinfección antes de su uso en manipulaciones quirúrgicas |
| Controlador de temperatura biológico con placa calefactora de acero inoxidable | equipo | Supertech | TMP-5b | |
| Tubo de borosilicato con filamento | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Aguja de vidrio |
| Brocas desechables | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbecco’s PBS 10X | reactivo | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Pinzas Dumont n.º 5, 110 mm | equipo | Fine Science Tools | 91150-20 | Tratar con etanol al 70 % para desinfección antes de su uso en manipulaciones quirúrgicas |
| Micropunción–tirador de electrodos | equipo | Ealing | 50-2013 | Tirador de electrodos de vidrio vertical |
| Ethilon poliamida monofilamento 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson &y Johnson | EH7177H | Hilos quirúrgicos |
| jeringa Exmire de 10,0 ml | equipo | Exmire | MS*GLLX00 | Jeringa hermética al gas |
| Verde rápido | reactivo | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Electrodos de fórceps | equipo | BEX | LF650P3 | Tratar con etanol al 70 % para desinfección antes del uso |
| Control de taladro Foredom | equipo | Foredom | FM3545 | Fuente de alimentación y control del taladro quirúrgico. El equivalente analógico actualmente disponible es el kit de micromotor K.1070 (Foredom) |
| manipulo de motor micro Foredom | equipo | Foredom | MH-145 | El kit de micromotor analógico actualmente disponible es el K.1070 (Foredom) |
| Plataforma de anestesia gaseosa para ratones | equipo | Stoelting Co. | 50264 | Ensamblado en instrumento estereotáxico |
| Isoflurano | reactivo | Baxter International Inc. | FDG9623 | |
| Pinzas microquirúrgicas para apósito, 105 mm | equipo | Aesculap | BD302R | Tratar con etanol al 70 % para desinfección antes de su uso en manipulaciones quirúrgicas |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Capilares para llenado de jeringas micro |
| Aceite mineral | reactivo | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Seringa NanoFil de 10 microlitros | equipo | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | jeringa Hamilton |
| plásmido CAG-EGFP | reactivo | Extraído y purificado con el EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) y disuelto en agua libre de nucleasas hasta una concentración de 1,5 mg/ml | ||
| Generador de pulsos CUY21Vivo-SQ | equipo | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| gel para electrodos Schiller | reactivo | Schiller AG | 2.158000 | Gel conductor |
| Instrumento estereotáxico para pequeños animales | equipo | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–adaptador para ratón y rata neonatal | equipo | Stoelting Co. | 51625 | Montado en instrumento estereotáxico. Tratar los bastones auriculares con etanol al 70 % para desinfección antes de su uso en manipulaciones quirúrgicas |
| Tijeras de iris para estudiante, rectas, 11,5 cm | equipo | Fine Science Tools | 91460-11 | Tratar con etanol al 70 % para desinfección antes de su uso en manipulaciones quirúrgicas |
| Hisopos absorbentes Sugi de 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Tampones quirúrgicos |
| Bomba de microjeringa UMP3 y controlador de bomba de microjeringa Micro 4 | equipo | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinyector y controlador |
| Unidad de anestesia Univentor 400 | equipo | Univentor | 8323001 |
Referencias
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2
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Reimpresiones y permisos
