Muchas infecciones provocan una respuesta CTL fuerte, pero de vez en cuando, la cantidad de células de respuesta no se correlaciona con el control del patógeno 1. Una medida de la calidad del CTL es su capacidad de matar específicamente 2. CFSE etiquetado de las células diana pueden ser utilizados para investigar la calidad de la respuesta CTL In vivo 3,4.
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Artículo de método
Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Diacetato de carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) puede ser utilizada para etiquetar con facilidad y rapidez una población celular de interés para la investigación en vivo. Este etiquetado tradicionalmente se ha utilizado para estudiar la proliferación y migración. En el método que aquí se presenta, hemos acortado la línea de tiempo después de la transferencia adoptiva de mirar la supervivencia y la muerte de las células CFSE epítopo específico etiqueta meta 6.4. El nivel de muerte específicas de un clon de células T CD8 + pueden indicar la calidad de la respuesta, ya que su cantidad puede ser engañosa. Específicas de células T CD8 + pueden llegar a ser funcionalmente agotado el tiempo con una disminución en la producción de citoquinas y matando a 7,8. Además, ciertos CD8 + clones de células T no se puede matar, así como otras con diferentes especificidades TCR 9. De la inmunidad mediada por células efectiva (CMI), los antígenos deben ser identificados que producen no sólo un número adecuado de responder las células T, sino también funcionalmente robusto responder las células T. Aquí se evalúa la eliminación de las células específicas por ciento de los dos péptidos clones específicos de células T en ratones Balb / c.
Protocolo
1. Provocando las metas específicas de Efectos CTL mediante la inmunización (día 0)
- Antes de empezar, decidir sobre un efector específicos: sistema de destino. En este ejemplo de un clásico ensayo in vivo del CTL, vamos a utilizar una vacuna de péptido purificado específico para obtener células T CD8 +. El mismo péptido se utilizará para el pulso de las células diana singénicas, la creación de un efector específicos: sistema de destino. Si lo prefiere, puede optar por utilizar patógeno total o proteínas para obtener su efectores y objetivos específicos.
- Descontaminar la superficie de trabajo en el interior de una campana de bios....
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Discusión
Este ensayo puede ser modificado para investigar la capacidad proliferativa de las células, incluyendo la expansión clonal, porque CFSE relativamente divide en partes iguales entre la progenie 10,11. También es posible utilizar el etiquetado CFSE para investigar la migración de células 6,12, aunque hay otra célula de seguimiento métodos que pueden ser más apropiados en función de su hipótesis, por ejemplo, tetrámeros y bioluminiscencia 13, que también se puede combinar con el etiquetado .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.
Agradecimientos
Me gustaría agradecer a Bianca Mothé, Oseroff Carla y Marie-France DelGuercio por haberme introducido en ensayos inmunológicos y el manejo del ratón. Trabajar en el laboratorio de GA Splitter es financiado por el NIH subvención 1-SR1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, y BARD Estados Unidos-3829-06.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| perlas de vidrio de 1 mm | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μfiltro de células tipo m | BD Biosciences | 352350 | |
| placa de 96 pocillos | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incompleto de Freund’s Adyuvante | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| SFB | GIBCO, por Life Technologies | 16000-077 | |
| Citómetro de flujo FC 500 | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Molinillo de tejidos de vidrio Kontes | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Aguja | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehído | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, de Life Technologies | 10010-023 | |
| Reactivo de lisis PharmLyse | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, de Life Technologies | 11875-093 | |
| Jeringa | BD Biosciences | 309602 | |
| Kit Vybrant CFSE | Invitrogen | V12883 |
Referencias
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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Reimpresiones y permisos
