Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

Resumen

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

Resumen

Este video muestra el procedimiento para la toma de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Los métodos de recogida de embriones y su dechorionation el uso de cloro se ha demostrado. Con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de succión de la boca, que ilustran la eliminación de todas las células de los embriones individuales. El método para la dispersión de las células de cada embyro en una pequeña (5 litros) gota de medio en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento se demuestra. Una vista a través del microscopio menos 1 hora después de la siembra ilustra la densidad celular preferida. La mayoría de las células que sobreviven cuando se cultivan en un medio definido son los neuroblastos que dividen a una o más veces en la cultura antes de extender los procesos de neuríticas por 12-24 horas. Una vista a través del microscopio muestra el nivel de crecimiento de las neuritas y la ramificación se espera en una cultura sana en 2 días in vitro. Los cultivos se envían en un bicarbonato de simple basada medio definido, en un 5% de CO ₂ incubadora a 22-24 ° C. Procesos neuríticas siga elaborando durante la primera semana de la cultura y cuando hacen contacto con neuritas de las células vecinas a menudo se forman conexiones sinápticas funcionales. Las neuronas en estas culturas, se manifiestan de voltaje de sodio, calcio, y los canales de potasio y son eléctricamente excitables. Este sistema de cultivo es útil para el estudio molecular de factores genéticos y ambientales que regulan la diferenciación neuronal, la excitabilidad, y la formación de sinapsis / función.

Protocolo

I. Drosophila de recogida de embriones

1. Preparar las placas de recolección de huevos
   1. Hervir 200 ml dH ₂ O con 8 g de agar
   2. Enfriar a 50 ° C
   3. Añadir 2 ml de EtOH y 2 ml de ácido acético
   4. Vierta la mezcla en 35 mm placas petri de plástico, tapas
   5. Dejar enfriar y guardar en un recipiente hermético a 4 º C
   6. Hace aproximadamente 80 placas
2. Preparar pasta de levadura
   1. Disolver la levadura para hornear Fleishmans activo en agua para formar una pasta
   2. Microondas por 20-30 segundos para matar la levadura (cuidado con los hirviendo)
   3. Tienda en jeringa de 10 cc....

Discusión

En cultivos de Drosophila preparado a partir de embriones etapa midgastrula las neuronas surgen a partir de precursores neuroblastos, muchos de los cuales se dividen antes de la diferenciación in vitro. Así, este sistema ofrece una oportunidad única para la exploración de los factores genéticos y ambientales importantes en las fases muy tempranas del desarrollo neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Hemos demostrado que las neuronas cultivadas en un medio simple definido diferenciarse en neuronas eléctricamente excitables, que también forma fun.......

Materiales

Los cultivos realizados en este medio de comunicación se debe mantener en un 5% incubadora de CO2 en alrededor de 22-24 º C. Nosotros usamos un estándar de cultivo de tejidos de mamíferos incubadora colocada en una habitación fría y se calienta a 23 ° C. Siempre se usa agua esterilizada filtrada y que en los envases que están reservados para los medios de comunicación y suplementos solamente. Nunca coloque un medidor de pH o una barra de agitación utilizados para otros fines en los medios de comunicación.