Summary
Bu video, aerobik mantar lignocellulosic bitki dokularında bozulma çalışma kontrollü bir ortamda bir yaklaşım göstermektedir. Besin kaynakları ve nem kontrolü için agar-blok microcosms yeteneği önemli bir avantaj, ancak bu yaklaşım genellikle karışık başarı verimleri. Biz, tekrarlanabilir, düşük değişkenlik verim kritik tuzaklar adresi.
Abstract
Ahşap koruyucu testi (agar-blok toprak blok) lignocellulosic bitki dokularında mantar biyodegradasyon eğitim için iki temel yöntem geliştirilmiştir. Toprak blok microcosms yüksek çürüme oranları, daha az nem sorunlarının, düşük çalışmalar arasında değişkenlik ve koruyucu toksisite eşikleri yüksek verim çok iyi kabul edilir. Toprak-blok test böylece daha fazla kullanılan bir tekniktir ve Amerikan Test ve Malzeme Derneği (ASTM) (yöntem D 1413-1407) tarafından standardize edilmiştir. Toprak-blok tasarımı, ancak yerel değişken toprak kaynakları kullanarak, sakıncaları ve çürüyen dokulara besin dış (eksojen) kontrolü sınırlandırılmasında. Bu sakıncaları, diğer giderek daha popüler araştırma amaçları için bu yöntemi uygulayarak bir sorun olarak ortaya çıkmıştır. Bu modern amaçları hifal ağları birlikte oksidatif mekanizmaları ve izleme transloke unsurları değerlendirirken, co-metabolize toksik biyoremidasyonu test biyoenerji araştırma, aşağılayıcı lignocellulosics içerir. Toprak-bloklar bu uygulamaların yeterince kontrol ödünç yoktur. Rafine agar-blok bir yaklaşım gereklidir.
Burada, ahşap aşağılayıcı mantar Serpula lacrymans düşük kalsiyum agar ile derin Petri kapları kullanarak, agar-blok microcosms ahşap düşmeye kahverengi çürüklük kullanın. Bir zaman serisi, çürüme eksojen alçı taşı rolünü test programı ve beklenen değişkenlik göstermek için. Tek bir yönetim kurulu rip (uzunlamasına kesilmiş) engeller, klimalı, tartılır, otoklava ve plastik hasır tepesinde aseptik tanıttı. Eksojen alçı arayüzler eklenmiş Mantar aşılar, her blok yüzüne. Hasat son yıkıcı hasata kadar aseptik. Bu microcosms agar veya Petri kabı duvarlar ile blok temasından kaçınmak için tasarlanmıştır. Yoğunlaşma plaka dökülen sırasında ve inkübasyon sırasında en aza indirilmiştir. Son olarak, inokulum / alçı / tahta boşluk izin vermeden, ancak temas en aza indirilmiştir. Bu agar-blok tasarımı daha az teknik yönlerini de başarısızlık ve en önemli çalışmalar arasında değişkenlik kaynağı en yaygın nedenlerinden. Video yayında bu durumda bu nedenle yararlı ve düşük değişkenliği, yüksek kaliteli sonuçlar göstermektedir.
Protocol
Bu protokol yanı sıra, fırın ya da hava kurutulmuş malzeme olarak, ana hatlarıyla, odunsu ve non-odunsu yüzeyler için geçerlidir. Ancak, set-up önce ilk protokolü üzerinden okuyun. Sizin çalışma için de geçerli olabileceğini gündeme birkaç noktaları ve bu noktaları (altı çizili) planlama gerektiren vardır. Ayrıca, Ahşap Korunmasına Dair Uluslararası Araştırma Grubu (IRG-WP) Kahramanlık (1978) tarafından sunulan kağıt, zaman zaman kullanılan iki yayınlanan agar-blok yöntemleri, İngiliz Standart 838 diğeri olduğunu unutmayın. Değişiklikler öncelikle mikrokozmosu tasarım ve agar kontrol yöntemi 838 benzer, ama yine, her iki yaklaşım da genellikle anoxia ve değişkenlik neden ahşap bloklar halinde tarihi nem kontrolü sorunları nedeniyle kaçınılır. Agar-838 standardı da dahil olmak üzere blok tasarımları, tartışma içeren bu test yöntemleri iyi bir eleştiri, Nicholas (1973) bulunabilir.
1) Microcosms hazırlanması
Bu çalışmalar için Microcosms ahşap bloklar üzerinde kafa alanı artan, tipik petri kaplarına 1 cm'den uzun boylu (derin). Konsantrasyonuna ek olarak, mutlak besin miktarları kontrol etmek ve mümkün olduğu kadar uzağa (> 3 mm), kapak, ahşap bloklar tutmak için agar mütevazı ve kesin miktarı ile doldurulur. Bu durumda, alçı test, agar bir düşük kalsiyum Tip A agar olan; Ancak, biz Blakeslee Kullanıcı orta, test (Wulfen: Fries) Serpula lacrymans izole korumak için ATCC tavsiye orta kullanarak temsili sonuçlar göstermektedir Schroeter suşu EMPA 65 ( ATCC 32.750).
Bu tasarım agar temas ve çanak kapağı ve duvarlar bitki dokularında uzak tutar. Lignocellulosic yüzeylerde Değişken ıslatma agar-blok testleri değişkenlik en önemli kaynağıdır. Nem içeriği artırmak için Islatma anoksi oluşturur ve bastırır, hatta durdurur aerobik biyolojik parçalanma. Aynı zamanda, herkes ahşap ayrışma sorumlu kahverengi ve beyaz fungusun oksidatif mekanizmaları eğitim için bir sorun oluşturur. Plaka kapakları üzerinde yoğunlaşma, ücretsiz su damlacıkları formu, bir sorun ve yüzey ıslak. Aynı şekilde,% 80 daha fazla nem içeriğine önde gelen (kuru ağırlık bazında) ve aerobik bozulma durdurulması temas, ahşap ve diğer dokulara agar hızla su 'fitil'. Dokular ipliksi mantar yüzey içinde bulmak, bağlamak ve kontrol nem sağlar, bu su kaynakları uzaklaşmış olmalıdır.
- 20 ml agar, her petri plakaların istenilen sayıda doldurmak için yeterli agar ortamında olun. Biz geçmişteki sonuçlar kullanılarak güç analizi ile belirlenen beş, tedavi başına (n = 5) çoğaltır kullanın.
- Kalsiyum ve demir-A Tipi agar için, 1.0 g NH 4 NO 3, 1.0 g tekbazlı KH 2 PO 4, 0.25 g MgSO 4 x değiştirilmiştir yaklaşık 400 ml deiyonize su içeren 500 ml.lik ölçülü balona 15 g agar 7H 2 O, ve 1.0 g glukoz. Karışımı için, biz mikrobesinler eklemek için stok solüsyonları kullanın. Biz 50 ul H 3 BO 4 (0.057 g / 100 ml) ve ZnSO 4 (0.031 g / 100 ml) ekleyin. Biz 50 ul MnCl 2 (0.036 g / 100 ml), CuSO 4 (0.039 g / 100 ml) ekleyin ve (NH 4) 6 Mo 7 O 24 (0.018 g / 100 ml). Besin 500 ml çizgisine ölçülü balona doldurup eklenir.
- Bu durumda tipik bir kalsiyum yanı sıra 0.05 g CaCl 2 x 2H 2 O / 500 ml olacaktır. Bizim durumumuzda, 5 mM son bir konsantrasyon ile, agar kalsiyum bir tedavi olarak kullanıyoruz. Biz diğer microcosms 5 mM NaCl ekleyerek iyonik kuvvet ve klorür ek olarak artış sayacı. Benzer şekilde, biz, bu gösteri için demir-ücretsiz medya kullanımı, ancak demir dahil olduğu durumlarda, 2 mL deiyonize su ile 0,112 g FeSO 4 karıştırın ve hemen vorteks sonra bu taze solüsyon 50 ul (hisse senedi) ekleyin . Besin eklemeler kontrol edilen herhangi bir ortam, otoklav önce pH test etmek akıllıca olacaktır. Asidik veya bazik eklemeler (örn. FeCl 3) katılaşma etkileyecektir.
- Bir şişe medya aktarın ve orta otoklavda 121 ° C ve 20 dakika boyunca 16 psi. Biz tüm test plakaları yönetebilirsiniz önce agar kuvvetlendirmek zorunda kalmamak için, 500 ml hacimli (1000 ml şişeyi başına) aşmamaktadır.
(Not:. Ilk test mantar büyüyecek doğrulamak için alternatif medya, özellikle az besin agar eklendi bazal tuzları kullanarak zaman bilge Yüksek iyonik güçlü büyümesini engelleyen ya da izole test öldürmek) - Biyogüvenlik kabini aseptik agar aktarmak için taşınabilir bir pipet yardımı ve 10 ml steril polistiren pipetler kullanın, bir kez serin şişeler. Dokunmak için medya serin Letting yoğunlaşma en aza indirmek için önemlidir. Ayrıca, ücretsiz su kapakları en aza indirmek için dökülür gibi yüksek plakalar yığını. Yoğunlaşma, normal kültür bir sıkıntı olsa da, burada büyük bir problem teşkil etmektedir eğer droplets formu ve ahşap ıslak. (Kuru ağırlık bazında) üzerinden% 80 nem içeriği (MC), aerobik mantar, doku sınırı çürüme anoksemi oluşturmak ve değişkenlik artış olacak. MC aşağıdaki gibi hesaplayın:
MC * = [(Taze ağırlığı x kuru ağırlık) / kuru ağırlık] x 100
* (Bu MC hesaplamak için garip bir yol gibi görünebilir, ancak standart MC% 100 aşabilir)- Alternatif microcosms: Eğer bitki dokularında test edilmektedir önceden öğütülmüş ve elenmiş (örneğin, mısır koçanı sapları ve yaprakları birlikte) olmalıdır, kullanan iki çanak seçenekleri vardır. Bölünmüş petri tabak, 2 veya 4 bölüm mevcuttur ve agar tozu ile bölmeleri dışında olabilir. Katılaştırılmış agar da kesilmiş ve bir kısmı tozu için odayı terk kaldırıldı, ancak bakım, bitki besin kontrol edilmesi durumunda kalan eşit agar hacimleri korumak için gerekli önlemler alınmalıdır olabilir.
- Cömertçe iyice yıkanmış ve otoklava ızgaraları aseptik kullanarak, levha yüzeyi plastik örgü ızgaraları kesmek ekleyin. Biz mesh için bir ürün, Cilt Guard (35 x 50 mm, 2 mm kalınlığında), kullanımı ve taramalı elektron mikroskobu, sonra sabun ve suyla yıkayın temiz bir yüzey ve mantar penetrasyon eksikliği göstermek için kullandık. Biz cam elyaf filtreler ve esneklik konular nedeniyle doğrudan geliştirilen Miseller döşeme blokları, hem karışık bir başarı oldu. Bu çürüme, ancak değişkenlik katsayısı (CV) tedavi karşılaştırmalar istatistiksel olarak zayıf, yüksek olacaktır. Daha önce cam çubuklar kullanılır, ancak blokları agar ile temas blokları bırakarak, çekeceğiniz zaman çubuklar kaymasını duyarlıdırlar. Bir inokulum karşılamak için bir kenarını keserek, tabak sığdırmak için tam daireler kesmek için iyi bir alternatif. Genel olarak, kendi set-up sığdırmak için ızgaraları kesmek, ama onlar petri kaplarına tamamen düz koymak emin olun.
2) 'Blok' Substratlar hazırlanması
Bu protokoller, masif ahşap için geliştirilmiş, ancak diğer bitki dokularında için uyarlanabilir. Kütle kaybı ipliksi mantarlar tarafından bozulmuş ahşap çürümeye ilerleme için standart ölçüsüdür. Böylece, bizim yaklaşım sonrası çürüme kütle kaybı belirlemek ve önceden fırın kuru ağırlıkları kullanır. Ancak, herhangi bir biyoenerji araştırma için, odak bitki doku kimya, birçok dokularda kuruma hava tercih edilir. Biz fırında kurutulmuş başlangıç materyali kullanmak için agar-blok kültürler hazırlamak için burada protokolleri gösterir, ama kuru ve hava tozu yerine katı substratlar işlemek için alternatif bilgi vermek.
- Bu gösteri için, Güney Sarı Çam (SYP) kullanın. SYP dört Pinus türlerinin herhangi biri olabilir ABD'de konut kullanılan kereste büyük çoğunluğu temsil eden bir piyasada bulunan kereste. Sigara tedavi kereste, tahıl (19 x 19 mm) birlikte kullanılır ve pürüzsüz blokları tek bir rip (uzunlamasına kesilmiş) kesilir. Bu ahşap kimyasal değişkenliği en aza indirir. Bu uzunluk, 19 mm 3 blok halinde kesilir . Biz toprak blok denemeleri için bu boyutunu kullanmak, ve masa üzerinde tek bir oturumda daha çok blok gördüm kesti.
- Agar-blok microcosms kullanılmak üzere 19 mm 3 blok, bir keski ve çekiç, testere kullanarak, tahıl boyunca yarı yarıya bölünmüş . Bu bir kaba blok kenarına plastik hasır ve pürüzsüz bir üst kenarı etiket yüzü aşağı yapar. Etiket blokları kalem ile. Substratları etiket yoksa, örnekleri ile yetişmek için bir sistem hazırlamak için emin olun. (Yine de, tedavi başına n = 5) tedavileri karşılamak için yanı sıra kirlenme monitörler ve paralel olarak klimalı temel veri örnekleri, hem de hizmet verecek inoküle kontrolleri yeterli blokları kesin.
- , 100 konveksiyon fırın, fırında kurutulmuş malzeme, yer örnekleri için ° C'de 48 saat süreyle. Hava kuru malzeme gerekiyorsa, durumu sürekli nem ve sıcaklık ile bir oda veya oda örnekleri. Biz% 65 RH ve 20 ° C, ve genellikle, malzemeye bağlı olarak 10-14 gün Klima güvenebilirsiniz.
- Ön tartmak ilk fırın kuru ya da taze ağırlığını belirlemek için senin örnekleri. Fırın örnekleri ile, sadece onları serin ve tartmak için bir desikatöre numune transfer.
- Hava kurutma hava kurutulmuş malzeme ile, beş numune almak Alternatif: (n = 5; kurban bu microcosms kullanılamaz), onları yukarıdaki gibi fırın kuru, onları taze tartmak ve kuruduktan sonra tekrar tartılır. Her iki blok aşağıdaki gibi için nem düzeltme faktörü hesaplayın:
MC düzeltme faktörü = kuru ağırlık / taze ağırlık
Örnek: 2.46 g (kuru) / 2.68 g (taze) = 0.918; böylece, 3.0 g taze blok 2.75 gram fırında kurutulmuş
Ortalama beş örnekleri ortalama düzeltme faktörü elde etmek için. Sonra, tüm hava kurutulmuş bloklar tartın. İlk fırın kuru ağırlıklarının belirlenmesinde her ağırlık ortalama MC düzeltme faktörü ile çarpın.
- Hava kurutma hava kurutulmuş malzeme ile, beş numune almak Alternatif: (n = 5; kurban bu microcosms kullanılamaz), onları yukarıdaki gibi fırın kuru, onları taze tartmak ve kuruduktan sonra tekrar tartılır. Her iki blok aşağıdaki gibi için nem düzeltme faktörü hesaplayın:
- Otoklav örnekleri etiketli 121 ° C ve daha büyük örnekleri ile 1 saat veya daha uzun süre için 16 psi Sıkıca ıslatma en aza indirmek için folyo.
- Alternative sterilizasyon: Varsa gama radyasyon, sterilize etmek için kullanılabilir. Biz hiçbir gücü kaybı ya da renk değişikliği ile birlikte, hemiselüloz kaybı sıcaklık etkileri önceden ladin ve kayın ağacından test ve hiçbiri bulundu. Ancak, bu yüzeyleri ve tercihleriniz / ihtiyaç arasında farklılık gösterebilir, ve gama ışınımı kanıtlanmış bir alternatiftir.
- Bu gösteri için, bizim çam (SYP) numunelerin bozulması katı alçı taşı rolü (1% FeSO 4 karşısında saf) test ediyoruz. Bunlar tekrar konsantrasyonuna ek olarak onların durumu kontrol etmek için, tam yüzey alanları ve hacimleri diskleri olarak yapılır. Bunlar ayrı ayrı otoklavlanabilir ve aşılama adım sırasında eklenmiştir. Biz her blok için bir disk ve iki hasat izin petri başına iki blok ekleyerek.
3) aşılamak ve Etiketleme
Agar-blok microcosms aşılamak toprak blok kavanoz aşılayarak daha zaman alıcı. Bizim için, biz 3 dk alarak her aşılama sayılır. Agar içeren petri kaplarına, örgü, ahşap, herhangi bir eksojen besin kaynakları (burada, alçı pelet) Ayrıca gelin ve mantar. Kapağı açık miktarı ve zaman içinde ziyaret sayısı nedeniyle, kirlenme olasılığı vardır artar. Genellikle bu aşamada yapılır ve bu en iyi video metin ile kaplin kapsadığı bazı önemli hatalar da vardır. Videoyu izleyin.
- Steril bir biyogüvenlik kabini, boş agar yemekleri, mantar inokulum (2 hafta kültürler), örgü, bitki substrat (ahşap), eksojen materyaller, sharpie, parafilm şeritler ve aktarım araçları için bir kaynak plakası monte edin. Biz alev% 70 etanol kullanılarak sterilize ve bloklar ve örgü için inokulum ve forseps için bir transfer aracını kullanın. Parafilm kenarlarında herhangi bir nicklerin önlemek için bir ustura ile kesilmesi gerekir. Kaparken parafilm içinde Nicks tatili kurşun, ve bu örnekleri çekmeye çabalamaktadır ve re-entry gerekecektir.
- Alev aktarım araçları veya aşağıdaki (bu sırada) eklemeden önce forseps:
- Plastik örgü.
- Ahşap zemin. Gösteri için, biz de biz erken ve geç hasat veri çifti böylece bölünmüş olan aynı başlangıç blok, iki ağaç blok mesh uzunluğu boyunca katacak. Bu bloklar, mantar inokulum kaynağı noktasında karşı karşıya tahıl sonunda (ahşap kesit) ile yan yana eklenir.
- Eksojen malzemeleri. Burada, bir ipliksi mantar çürüme alçı taşı rolünü test ediyoruz. Bu nedenle, odun ulaşmadan önce bu alçı diskleri karşılaşmaya mantar istiyorum, ve böylece mesh üstüne her inokulum noktası ve blok arasında bir alçı disk eklemek. Bu mikrokozmosu başına 2 diskler ekleyerek anlamına gelir. Diskler ve ahşap arasındaki temas ettirmeyin, fakat bunları yakın bir yerde muhafaza etmeyin.
- Mantar inokulum. Biz 7 mm çapında, 20 ml agar yetiştirilen 2 hafta kültürlerden gelen fişler yapmak için # 4 mantar delici kullanın. Bu inokulum hacmi kontrol etmeye yardımcı olur. Olmayan inoküle kontroller için, steril bir plakadan bir eklenti eklemek için en iyisidir. Biz genellikle agar bu fişler ve mesh değil. Inokulum ve eksojen substratları veya ahşap arasındaki temas izin, ancak yine onları birbirine yakın yerde bırakmayın. Blok başına bir inokulum fiş vardır.
Not: ahşap bloklar ve kapağı duvarlar arasında en az 3 mm mesafe olacak ki, en az 3 mm kafa boşluk olacak emin olmak için başlamadan önce bir agar çanak bu içerikleri bir araya akıllıca olduğunu ve plastik hasır boyutları kolayca substratlar karşılamak.
- Parafilm yemekleri alkol alev yanan tutmak, onları mühür ve forseps hazır. Düzgün bir sürekli hareket yatay plakalar ve wrap parafilm tutun. Eğer parafilm kesmeleri veya eğer içeriğini çekmeye çabalamaktadır, kaldır parafilm, yeniden girmek ve içeriğini monte ve tekrar deneyin.
- Çanak kapakları, blok numaralarını doğrudan ilgili yüzeylerin üzerinde etiketleme alkole dirençli işaretleyici, kullanarak etiketleyin. Ayrıca alçı diskler üzerinde daireler çizin. Ahşap bozunmaları gibi, büyük olasılıkla yüzeylerde etiketleme okuma yeteneğini kaybedersiniz. Çanak pozisyonu ile tutmak için önemlidir. Ayrıca, aşağılamak veya diğer malzeme türleri, metaller de dahil olmak üzere sayısız kolonize bir mantar yeteneği yabana atmayın.
- Örgü hassas topluluğu varsa, inkübatör DİKKATLE plakaları aktarımı. Biz, sadece bir kez, bir kapı sıkışmasına karşı plaka bin çarptı ve yeniden monte plakaları zorunda kaldı. Zaman ayırın ve rotanızı arsa. Bu bir kerelik bir sorundur, bu nedenle dikkatli bir zaman alabilir.
4) Hasat ve kuluçka
Tabaklar, mantar uygun sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle yoğunlaşmasından inkübe olabilir, ama eğer mümkünse biyolojik bir inkübatör tutulmalıdır. Zaman serileri hasadın son hasat dışında, aseptik yapılır. Eğer bu ara üzerinde büyümeyi sonra hasat yapılıryüzeylerde hifler çapraz link substratlar çünkü plakalar ele kolaydır, önemli.
- Gösteri için, biz, 20 ° C'de ve karanlıkta plaka inkübe edin. Haftada 5 hasat noktada, biz, tüm tedavi çok kaldırmak, alt ve üst% 70'lik etanol ile her sprey ve biyogüvenlik kabini içinde malzeme çıkarmak için Alevli forseps kullanabilir.
- Agar plakları yok, herhangi bir morfoloji veya melanization odaklanarak önce fotoğraflar çekin.
- Gereksinimlerine göre tedavi edilmesi blokları kaldırmak. Uzaklıkta aşırı hif rulo (nitril eldiven ile), ancak herhangi bir çürük malzeme kaybetmemek için dikkatli olmak parmağınızı kullanın. Biz genellikle alüminyum fırın kuru blokları aşırı esneklik izlemek için taze ve kuru ağırlıkları kontrolleri kullanarak, kütle kaybı belirlemek için tava tartın. Ayrıca bu yaklaşım, en az düzeyde olması gerektiği halde, etiket ve net bir şekilde suyun kaydedilir herhangi bir koyu kahverengi bloklar izlemek. Kütle kaybı verileri göstergesi çürüme ilerleme yardımcı olur ve elementel konsantrasyonların sonra, bir gram ağırlık bazında hesaplanacak eğer önemli veridir. Ayrıca yüzde veriler, istatistikler için normalize olması gerektiğini unutmayın. Şu şekilde hesaplayabilirsiniz:
% Kütle kaybı = [(ilk ağırlık son ağırlık) / ilk ağırlık] x 100- Alternatif hava kurutma: daha fazla malzeme biyolojik tedavi etmek amacı ile, hava kurutma ihtiyacınız varsa, yenilemek için Bölüm 2.3 'Klima rejimi kullanmanız gerekir. Kütle kaybı belirlemek gerekiyorsa, nem içeriği bir önlem gerektirir, Bir çözüm, küçük ve büyük bir kısmını içine bloklar (veya toz) bölünmüş. Hem de tartılır, ancak sadece küçük bir kısmını fırın kuru. Toplam taze ağırlığı uygulamak sonra yukarıdaki gibi, nem içeriği dönüşüm faktörü hesaplayın ve küçük + büyük porsiyon (toplam blok taze ağırlık). Saccharification ya da diğer işlemler, kütle kaybı için önce bir mantar malzeme pretreating sonra ve hesapları mantar tüketilen karbonhidratlar için kütle dengesi kararlılıkla yardımcı olacak, özellikle eğer.
- Otoklav torbaları kültürleri yok, ancak gelecek deneylerde kullanılmak üzere geri dönüştürülebilir plastik destek mesh ve diğer bileşenleri kaydedin.
5) Sonuçlarının Yorumlanması
Lignocellulosic dokular genellikle agar-blok tasarımları yavaş çürümeye, ama bu noktada, göreceli olarak düşük, orta çürüme düzeyde bile değişkenlik olması gerekir. Ayrıca kontrol dokularında orta (% 20-50), yüksek neme sahip olmalıdır.
- Mantara maruz ahşap nem içeriği (kuru ağırlık bazında) bu gösteriye yaklaşık% 40, genellikle orta. Bu çam lignocellulosic ikincil hücre duvarı içinde bağlı su fazlalığı bazı ücretsiz su var demektir fiber doyma noktasına (FSP) (normalde yaklaşık% 24) üzerindedir. Bu aynı zamanda bazı esneklik muhtemelen oluşur anlamına gelir. % 100 bir RH hala ahşap MC FSP aşmak için izin vermemelidir. Tasarımı, substrat ve örgü seçimi bağlı olarak farklı sonuçlar elde edebilir. Anahtar kuru ağırlık bazında% 85 ya da altında nem içeriğini tutmak için.
- Bu agar-blok microcosms bozulmuş ahşap% kütle kaybı çoğu mantarlar için 16 hafta sonra genellikle% 30 civarındadır. Bu durumda Serpula lacrymans seçin mantarlar, mantarlar bu süre içinde,>% 60 kütle kaybı tam bozulma elde edersiniz. S. lacrymans az lignin çıkarmadan, kahverengi bir küf mantarı, bu denemede% 62 kütle kaybı, çürüme veya geçmişte yakın tamamlanması anlamına gelir. Beyaz fungusun lignin kaldırır, ve kütle kaybı tür olarak iyi substrat olarak bağlıdır.
- Hifal morfolojisi kaydetmek için özen gösterin. Bu gösteri, hifal morfolojisi doğal olarak herhangi bir tedavi başarı ya da başarısızlık değildi, ama melanization renkler önemliydi. Bu bize yerli malzeme test edildi ve bu 'pas' renklendirme gözlendi Düşük ve ark. Gibi büyük çalışmalar (2000), demir, alçı bir kirlilik olarak rolünü ilgili izin verdi . Düşük ve ark (2000), kalsiyum ve demir rolü tartışıldı ve burada demir, kalsiyum ile gelişmiş çürüme ve bu aynı pas renkli hifler .
- Bu bozulmuş ahşap şey konsantrasyonlarını ölçmek istiyorsanız, bu kütle kaybı için normalleştirmek için en iyisidir. Örneğin, kalsiyum ne ithal veya ihraç edilen ahşap,% 50 çürümesi Eğer bir ağırlık bazında konsantrasyonu son hasat zaman sıfır çift görünecektir. 1 gr toz zaman sıfır daha iki katı ağaç hacmi temsil ettiği budur. Mantar yoğunluğunun azaltılmasının,% 50 matris tüketilmektedir. Normale aşağıdaki gibi kütle kaybı telafi etmek için herhangi bir konsantrasyonu (örneğin mmol / g):
Normalize konsantrasyon = mmol / gx [1 - (% Kütle kaybı / 100)]
Örnek: 10 mmol / g Ca ahşap bozulmuş% 20, karşı 7 mmol / g süresi sıfır.
Soru: çürüme sırasında Ca içeriği artış mı?
10 mmol / g belirgin bir 3 mmol / g artış,% 43 bir artış, ama one gram toz düşük yoğunluklu bozulmuş ahşap şimdi daha büyük bir hacmi temsil eder. Normalizasyon eşit ahşap cilt olarak ilk ve son Ca içeriğini karşılaştırmak için gereklidir.
10 x [1 x (% 20 / 100)] = 8 mmol / g normalize
Cevap: Evet, Ca artışı, ama% 14,% 43 değil.
(Veri yoğunluğu ile çarpılarak ahşap hacmi, mmol / cm 3 başına ifade edilebilir.
Şekil 1 Agar blok mikro-inkübasyon önce, bu gösteriye.
Şekil 2 agar temas yukarıda bloklar yükseltmesine plastik hasır üzerinde duran çam ahşap bloklar kolonize Serpula lacrymans. Bu misel ahşap ve eksojen besin / eleman kaynakları arasında önemli bir bağlantı temsil eder ve karşı toprak-blok tasarımı, agar ya da katı malzeme olarak bu eksojen maddi kaynakları kontrol agar-blok tasarımı önemli bir avantaj.
Şekil 3.% Ortalama kilo kaybı, agar-blok microcosms çam ile 5 ve 15 hafta inkübasyondan sonra Serpula lacrymans ahşap çürüme ölçüde bir önlem olarak. Yok (Ca-ücretsiz), 5 mM CaCl 2 agar (CaCl 2) Tedavi eklendi,>% 99 saf alçı (CaSO 4), ya da 1,% alçı demir-değiştirilmiştir . Korumalı ANOVA karşılaştırmalar ile α = 0.05, Tukey testleri kullanılarak anlamına gelir. Her hasat için, aynı harf altında çubukları önemli ölçüde farklı değildir. Hata çubukları = standart sapma. Schilling (2010) Yayınlandı.
Şekil 4 Tepegöz resim (A) beşinin aynı kahverengi çürüklük testi mantar, Serpula lacrymans yanı sıra bloklar (B) kaldırılır ve fırında kurutulmuş çürüme hafta 15 çoğaltır. Not Ca-ücretsiz tedavi melanization eksikliği, saf kalsiyum tedavileri sararma ve demir-tadil tedavisinde pas görünüm. Tedaviler, karşılaştırma için (B) olmayan inoküle olan bloklar halinde kontrol Şekil 3 olarak etiketlenir.
Şekil 5 demir konsantrasyonu yüksek bir orta, Blakeslee malt agar kullanarak farklı bir deneme Tepegöz resim. Şekil 4 ile karşılaştırıldığında gözlenen melanization kaybı, dikkat edin. Çıkarılır ve tartılır Blokları, kilo kaybı üzerinde hiçbir tedavi etkisi gösterdi. Bu, bu blok çalışmaların dışsal bileşenlerinin etkisi bir göstergesi olarak sunulmaktadır. Bu etkiler, bu eksojen girişleri kontrol etmek çok zor, toprak blok kavanoz tasarımları test edilebilir olması olmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agar-blok set-up (Şekil 1) kullanarak Serpula lacrymans (Şekil 3 kontrol kahverengi-çürümüş çam blokları% 60 daha fazla kilo kaybına yol açan, alçı yüzeyler ve ahşap bloklar (Şekil 2) içine doğrudan temas halinde büyüdü .) Bu kolay çürüme>% 50 ASTM standart hedefi tatmin ve az çürüme ortalama varyasyon katsayısı (C V) 0,055 16. hafta. Bu veri Schilling 7 yayınlanmıştır. Yine, diğer mantar agar-blok toprak blok daha uzun kuluçka gerekecektir. Başvuru için, biz sık sık eksojen bağlantıyı doğrulamak için elektron dispersif spektroskopi (SEM-EDS) ve indüktif eşleşmiş plazma spektroskopisi (ICP-OES), taramalı elektron mikroskobu kullanılarak başarıyla diğer mantar türlerinin çeşitliliği ile birçok geçmiş deneylerde benzer tasarımlar var yüzeyleri ve ahşap 8,9 içine kalsiyum ve diğer elementlerin translokasyon.
Düşük değişkenliğin yanı sıra, diğer iki sonuç agar-blok tasarım ortaya koymaktadır vardır. Birincisi, bizim kalsiyum eklemeler, agar olmadığını CaCl 2 veya saf alçı gibi, bu mantar çürüme inhibe bir tedavi etkisi (Şekil 3), vardı. Diğerleri kalsiyum, harç ve sıva gibi gerçek dünya malzemeleri ile çalışmalara göre teorize çürüme artırır, çünkü bu yararlı bir sonuç. Bunun yerine, demir, kalsiyum değil düşündüren, alçıtaşı, demir ilavesi ile çürüme oranları ribaund görmek anahtarıdır. Ancak ikinci yararlı sonucu, sayısal değil ama onun yerine Miseller renk (Şekil 4). Dış hifler tedaviler arasında önemli ve açık melanization farklılıklar ve yapı malzemeleri bu mantar karşılaşan araştırmacılar, daha önce (örneğin, düşük ve ark 2000) 'pas' melanization kaydetti var. Daha yeni çalışmalar, bu etkileri yüksek bir demir orta (Şekil 5) kullanarak kaybolur bulundu. Topluca, 'paslı' Miseller bu mantar, bu malzemeleri ve daha önceki çalışmalarda, demir, kalsiyum değil kullanan rapor, kalsiyum etkisi, demir etkisi olmayan gözlemleyerek olduğunu göstermektedir.
Genel olarak, bu sonuçlar, yüksek demir agar kullanılarak tedavi etkileri eksikliği agar-blok tasarımı, özellikle alternatif toprak blok yaklaşımı ışığında, araştırmacı sağlayabilir kontrolü çok güçlü bir gösteri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
- ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . Annual Book of ASTM Standards. , 185-192 (2007).
- Bravery, A. F. A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).
- Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry. Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).
- Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments. , Syracuse University Press. (1973).
- Schilling, J. S. Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans. Holzforschung. 64, 93-99 (2010).
