Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Resumen

Método fiable para alta eficiencia In vitro Expresión y posterior registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK-293T).

Resumen

La expresión in vitro y de registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK-293T) es una estrategia de investigación en todas partes. HEK-293T las células deben ser sembradas en cubreobjetos de vidrio con una densidad lo suficientemente baja para que no estén en contacto unos con otros con el fin de permitir registro electrofisiológico, sin factores de confusión debido al contacto con las células adyacentes. Canales transfectadas también debe expresarse con la máxima eficiencia en la membrana plasmática de células enteras de grabación de patch clamp de las corrientes detectables por encima de los niveles de ruido. Canales de iones heteróloga a menudo requieren largos períodos de incubación a 28 ° C después de la transfección con el fin de lograr la adecuada expresión en la membrana, pero cada vez hay más pérdidas de adhesión célula-cubreobjetos y estabilidad de la membrana a esta temperatura. Para evitar este problema, hemos desarrollado una estrategia optimizada para transfectar y la placa de HEK-293T las células. Este método requiere que las células se transfectaron en una confluencia relativamente alto, y se incuba a 28 ° C durante diferentes períodos de incubación después de la transfección para permitir la expresión de la proteína adecuada de los canales iónicos. Células transfectadas se está chapada en cubreobjetos de vidrio y se incuba a 37 ° C durante varias horas, lo que permite la adhesión celular rígido para los cubreobjetos y re-estabilización de la membrana. Las células se pueden grabar poco después de la siembra, o pueden ser transferidos a 28 ° C de incubación. Nos encontramos con que la incubación inicial a 28 ° C, después de la transfección de las placas, pero, es la clave para la expresión eficaz de los canales iónicos heteróloga que normalmente no se expresan así en la membrana plasmática. Positivamente transfectadas, las células cultivadas se identifican por co-expresó eGFP o eGFP expresa a partir de un vector bicistrónico (por ejemplo, pIRES2-EGFP) que contiene el canal de iones cDNA recombinante justo aguas arriba de un sitio interno de entrada de ribosomas y una secuencia de codificación eGFP. De células enteras de grabación de patch clamp requiere equipo especializado, además de la elaboración de electrodos de registro y pulido en forma de L electrodos de masa de vidrio de borosilicato. La administración de fármacos para el estudio de la farmacología de los canales iónicos se puede conseguir directamente micropipetting drogas en el plato de grabación, o mediante el uso de microperfusión o sistemas de desagüe que producen flujos ininterrumpidos de solución del fármaco sobre las células registrado.

Protocolo

1. Cultivo de células

1. De riñón embrionario humano células 293T (HEK-293T, Invitrogen) se cultivan en monocapas adherentes en ventilados 25 cm ² frascos (cultivo de tejidos tratados, Cellstar, Greiner Bio-One), que contiene 6 ml de Dulbecco modificado Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich), complementado con 10 % v / v de suero fetal bovino (SFB, Sigma Aldrich), 1% de piruvato de sodio y 250 mg / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO _2).
   
   Las células se incubaron en incubadoras de CO ₂ (5% CO ₂₎ establece en 37 ° C o 28 ° C. Todo el trabajo con las células se realiza en una campana....

Discusión

Ser capaz de grabar de células enteras corrientes utilizando los protocolos descritos y las soluciones indica que la transfección se ha realizado correctamente y que la tensión deseada canales iónicos o complejos de los canales iónicos están presentes con importantes cantidades en la membrana celular. En caso de que las células transfectadas de manera positiva (es decir, verde fluorescente), pero no tienen corrientes de grabación, el tiempo adicional a los 28 ° C puede ser necesaria para permitir la proteína del canal d.......

Materiales

Material	Empresa	Número de catálogo	Comentario
pIRES2-EGFP plásmido	Clontech	6029-1
Círculo de vidrio cubreobjetos	Fisher Scientific	12-545-80	Círculos No. 1 - 0,17 mm de espesor de 0,13 a, Tamaño: 12 mm
Amplificador	Axon Instruments	Axopatch 200B o 700B MultiClamp
Sistema de Adquisición de Datos	Axon Instruments	Digidata 1440A
Software de Electrofisiología	Axon Instruments	pClamp10.1
Pipeta de manipuladores	Sutter Instrument Co.	MPC-385 a 2
Microscopio invertido de epifluorescencia	Zeiss Canadá	Axiovert 40 CFL
Headstage	Axon Instruments	CV-7B
Headstage portaelectrodos	Axon Instruments	1-HL-U
Microelectrodo soporte para electrodo de tierra	Mundial de Instrumentos de Precisión	MEH3RF 15
Electrofisiología tubos capilares	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	Vidrio de borosilicato con filamento, OD 1.5mm OD, 0.86mm, 15 cm de largo
Flaming / Brown Micropipeta Extractor	Sutter Instrument Co.	P-97
Micropipeta fuego pulidor	Narishige	Micro Forge MF-830
Micro sistema de perfusión de drogas	AutoMate Científico	SmartSquirt8 Valvelink8.2
Sistema de perfusión de drogas	AutoMate Científico	Valvelink8.2 con Teflon válvulas