Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

Resumen

Este trabajo describe la metodología para determinar la respuesta quimiotáctica de los leucocitos a ligandos específicos e identificar las interacciones entre los receptores de superficie celular y proteínas citosólicas utilizando técnicas de imagen en vivo de la célula.

Resumen

Receptores acoplados a proteína G (GPCR) pertenecen a la familia de proteínas transmembrana siete y mediar en la transducción de señales extracelulares de respuestas intracelulares. GPCRs control de diversas funciones biológicas como la quimiotaxis, la liberación de calcio intracelular, regulación de los genes de una manera dependiente de ligando a través de heterotrimeric proteínas G ^1-2. Unión del ligando induce una serie de cambios conformacionales que conducen a la activación de heterotrimeric G-proteínas que modulan los niveles de segundos mensajeros como el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), inositol trifosfato (IP3) y glicerol diacil (DG). Concomitante con la activación de la unión del ligando del receptor también inicia una serie de eventos para atenuar la señalización del receptor a través de la desensibilización, el secuestro y / o internalización. El proceso de desensibilización de GPCRs se produce a través de la fosforilación de los receptores de las quinasas del receptor de la proteína G (GRKs) y posterior unión de β-arrestins ^3. β-arrestins son proteínas citosólicas y trasladar a la membrana de la activación de GPCR, la unión a receptores fosforilados (la mayoría de los casos) que, al facilitar la internalización del receptor ^6.4.

Leucotrieno B ₄ (LTB ₄₎ es una molécula pro-inflamatoria lípidos derivados del ácido araquidónico vía y media sus acciones a través de GPCRs, LTB ₄ receptor 1 (BLT1, un receptor de alta afinidad) y LTB ₄ receptor 2 (BLT2, un receptor de baja afinidad ) ^7-9. El LTB ₄ BLT1 vía ha demostrado ser crucial en varias enfermedades inflamatorias, entre ellas, el asma, la artritis y la aterosclerosis ^10-17. El presente documento describe las metodologías desarrolladas para controlar LTB _4-inducida por la migración de leucocitos y las interacciones de BLT1 con β-arrestina y translocación de los receptores en las células vivas mediante técnicas de microscopía ^18-19.

La médula ósea procedentes de células dendríticas de ratones C57BL / 6 fueron aisladas y cultivadas como se describió anteriormente ^20-21. Estas células se pusieron a prueba en vivo de imágenes de células métodos para demostrar LTB ₄ migración celular inducida. El BLT1 humanos fue etiquetado con la proteína roja fluorescente (RFP BLT1-) en el C-terminal y β-arrestin1 etiquetados con una proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) y se transfectaron los plásmidos, tanto en rata basófilos Leukomia (RBL-2H3) las líneas celulares ^18-19. La cinética de la interacción entre estas proteínas y la localización se controlaron mediante microscopía de vídeo en directo de la célula. Las metodologías en el presente documento describe el uso de técnicas de microscopía para investigar las respuestas funcionales de los receptores de la proteína G de acoplamiento en las células vivas. El presente documento también describe el uso de software Metamorph para cuantificar la intensidad de fluorescencia para determinar la cinética de los receptores y las interacciones de las proteínas citosólicas.

Protocolo

Metodología

Descripción del Microscopio

Experimentos en vivo de imágenes de células realizó con TE-FM Epi-Fluorescencia sistema conectado al microscopio Nikon Eclipse TE300 invertido. El microscopio equipado con fase de calentamiento. Un fresco presión HQ digitales B / W CCD (Roper científico) de la cámara y LAMDA 10.02 óptico cambiador de filtros (compañía de Sutter instrumento) se une al microscopio. Longitudes de onda de excitación y emisión se controla con ruedas de filtros y control de Lamba 02.10 controlador rueda de filtros, Sutter Instruments Co. Tiempo de exposición de 500 ms debería ser suficiente para ve....

Discusión

Imágenes de células vivas es una poderosa herramienta para demostrar la función y las interacciones de las proteínas específicas que se producen en tiempo real. Los métodos descritos en este manuscrito muestra claramente que LTB ₄ puede inducir una rápida migración de las células dendríticas. Estos métodos no sólo ampliar los aspectos de LTB ₄ en función de diversos tipos de células, que permiten a los mismos métodos que se aplican a una variedad de otras quimiocinas y pruebas de su eficacia como a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-2H3) o células HEK293.	ATCC	CRL-2256
Delbecco’s modificado de Eagle’Medio DMEM	Invitrogen	11995
RPMI o DMEM sin rojo de fenol	Invitrogen	11835-030
Suero bovino fetal	Invitrogen	16000-044
L-glutamina (200 mM)	Invitrogen	25030
Penicilina-estreptomicina (10000 U/mL)	Invitrogen	15140
Tripsina, 0,05 % (1X) con EDTA 4Na, líquido	Invitrogen	25300
HEPES (1 M)	Invitrogen	15630
Placas Fluoro con fondo de cubreobjetos de vidrio estéril de 35 mm (0,17 mm de espesor) (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Cubeta estéril para electroforesis (hueco de electrodo de 0,4 cm) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
Electroporador Gene Pulser II	Bio-Rad
Sistema TE-FM de epi-fluorescencia acoplado al microscopio invertido Nikon Eclipse TE300	Nikon Instruments
Software Metamorph	Imagen universal
Micro-pipeteador vertical	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
Micromanipulador hidráulico MO-188NE	Narishige International
Manipulador manual grueso, MN-188NE	Narishige International
Construcciones de ADNc:
cDNA del receptor acoplado a proteína G marcado con proteína fluorescente roja en el extremo C-terminal (hBLT1-RFP)	Jala et al 2005
cDNA de proteína citosólica marcada con GFPβ-arrestina1-GFP en el presente estudio).	Jala et al 2005