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Modelado de membranas biológicas con placas de circuitos y medición de señales eléctricas en los axones: Ejercicios de laboratorio para estudiantes

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DOI:

10.3791/2325

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18 de enero de 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Esta es una demostración de cómo las membranas biológicas se puede entender el uso de modelos eléctricos. También demuestran los procedimientos para el registro de potenciales de acción desde el cordón nervioso ventral de los cangrejos de río para los laboratorios de los estudiantes orientados.

Resumen

Esta es una demostración de cómo los modelos eléctricos pueden ser utilizados para caracterizar las membranas biológicas. Este ejercicio también se presenta la terminología utilizada en biofísica de electrofisiología. El mismo equipo que se utiliza en el modelo de membrana como en la preparación en vivo. Algunas propiedades de un cable aislado al nervio son investigados: los potenciales de acción del nervio, el reclutamiento de las neuronas, y la respuesta del cordón nervioso a los factores ambientales.

Protocolo

1. INTRODUCCIÓN

1.1) Antecedentes

Un conocimiento fundamental de los circuitos eléctricos es una herramienta valiosa para comprender y conceptualizar muchos aspectos de la experimentación y teoría fisiológica. Este ejercicio tiene como objetivo familiarizarlo con algunos principios generales que involucran fuentes de voltaje, resistencia eléctrica y capacitancia eléctrica. Estos conceptos introductorios proporcionan la base para entender fenómenos como la transmisión sináptica y la propagación de señales eléctricas a lo largo de una fibra nerviosa.

Una advertencia: en los circuitos eléctricos cotidianos estándar compuestos por alambres metálicos y resistores, la CORRIENTE es transportada por electrones, que tienen carga negativa. En los sistemas biológicos, la corriente es transportada por IONES, que pueden tener una o más cargas positivas o negativas. Por convención, la corriente fluye de positivo a negativo (aunque, por supuesto, los electrones en realidad se mueven en sentido opuesto).

Los componentes del circuito representan las propiedades eléctricas de los tejidos vivos y, en algunos casos, de objetos inanimados (como electrodos) involucrados en su estudio.

Al realizar el ejercicio, tome notas de los resultados y los cálculos.

1.2) Principios generales

Las propiedades básicas de los circuitos eléctricos por los que fluye corriente continua se describen mediante la ley de Ohm
V = IR
Donde V = voltaje en voltios (V)
I = corriente en amperios (A)
R = resistencia en ohmios (Ω)

Esta ley rige los potenciales que se observan en las células nerviosas con electrodos. Primero demostraremos la ley de Ohm y su aplicación en materiales biológicos.

1.3) Materiales

ElementoCantidad
Placa de pruebas1
Resistencias: 330 K Ω1
: 100 K Ω12
: 33 K Ω6
: 22 K Ω1
: 10 K Ω6
: 4.7 K Ω1
: 2.2 K Ω1
: 1.5 K Ω1
: 1 K Ω1
: 510 Ω1
: 330 Ω1
: 220 Ω1
: 150 Ω1
: 100 Ω1
Capacitores: 0.1 μF6
: 10 μF6
Cables12
PowerLab1
Conductores de salida del PowerLab1
Conductores de entrada del PowerLab1
Voltímetro (con capacidad de corriente)1

Clave de codificación de resistencias

ColorDígito
Negro0
Marrón1
Rojo2
Naranja3
Amarillo4
Verde5
Azul6
Violeta7
Gris8
Blanco9
Plata10% de tolerancia
Oro5% de tolerancia

1ª banda: 1er dígito
2ª banda: 2º dígito
3ª banda: número de ceros
4ª banda: tolerancia

Montaje del experimento electrónico con computadora, multímetro y placa de pruebas para análisis y pruebas de circuitos.
Figura 1: Configuración del sistema. Computadora, placa de pruebas y laboratorio de alimentación con estimulador de salida.

El sistema PowerLab (interfaz PowerLab de AD Instruments, Australia) servirá como fuente de voltaje en este experimento. Conecte el cable USB del PowerLab a la computadora, encienda el PowerLab y abra el programa LabChart desde el escritorio. Seleccione "Nuevo archivo". Aparecerá una ventana con múltiples canales de grabación. Seleccione "Configuración" en la parte superior y haga clic en "Ajustes del canal". En la esquina inferior izquierda de la ventana, reduzca el número de canales a 1; en el canal 1, cambie el rango a 5 V. Conecte el cable estimulador con los dos conectores mini gancho a los puertos de salida del PowerLab: conecte el cable con conector rojo al puerto de salida positivo y el cable con conector negro al puerto de salida negativo. A continuación, es necesario modificar la salida de potencia, la frecuencia y la duración del pulso del PowerLab. Para ello, seleccione "Configuración" y luego "Panel de estimulación". En la primera parte del experimento se requieren pulsos largos de 1,5 V, por lo que debe ajustar la amplitud a 0,75 V; esto proporcionará un rango de 1,5 V (el PowerLab emitirá un voltaje que fluctuará entre +0,75 V y -0,75 V). Establezca la frecuencia (0,5 Hz) y la duración del pulso (1 s).

Diagrama de electroforesis; proceso de separación de ADN; las bandas del gel muestran diferencias de peso molecular
Figura 2: Esquemas del protoboard. Las tiras de color a lo largo de los lados están conectadas todas como una unidad para cada color. Las 2 columnas horizontales en el centro están conectadas en cada mitad, para una fila determinada, pero no cruzan la línea media ni se conectan con las tiras laterales. Cada fila del centro es independiente de la fila siguiente.

Al utilizar una placa de pruebas, existen dos columnas a cada lado que se usan para los terminales de entrada y salida. Generalmente, el terminal positivo se conecta a la columna positiva derecha, en la cual todos los orificios de la columna están interconectados. La entrada negativa se conecta al lado opuesto de la placa de pruebas, donde, nuevamente, todos los orificios dentro de una columna están conectados entre sí. En el centro, entre los dos conjuntos de columnas, hay múltiples filas de cinco celdas, cada una independiente de las demás. Todos los orificios en una fila de cinco están conectados entre sí, pero aislados de las otras filas. Consulte la Figura 2. Las regiones resaltadas muestran qué partes de la placa de pruebas están interconectadas. Un video útil sobre el uso de la placa de pruebas está disponible en línea en http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related

Ejercicio 1

Utilice la ley de Ohm para calcular la CORRIENTE que fluye a través del siguiente circuito:
Diagrama de circuito eléctrico, equilibrio estático, batería de 1.5 V, resistor de 1500 Ω, análisis de corriente.
Corriente (Red 1): ________________ A

Ejercicio 2
Mida el voltaje a través de la resistencia, la resistencia del resistor y la corriente que fluye a través del circuito anterior (Red 1).

Multímetro digital mostrando el valor de capacitancia; esencial para mediciones y diagnósticos eléctricos.
Figura 3: Voltímetro Wavetek Meterman.

Reconstruya la Red 1 en la placa de pruebas utilizando una resistencia de 1500 Ω; el PowerLab sirve como fuente de voltaje (1,5 V). Las mediciones de voltaje, corriente y resistencia se realizan con el voltímetro. Para que el voltímetro obtenga datos precisos, tanto la sonda roja como la negra deben estar en contacto con el alambre desnudo del circuito. Además, el selector debe ajustarse al voltaje de corriente continua (DC) en un rango adecuado para la escala de cada configuración experimental. Para la medición de voltaje, toque ambos extremos de la resistencia con las sondas del voltímetro. Al medir la resistencia de la resistencia (no la caída de voltaje), DESCONECTE la fuente de voltaje y, nuevamente, toque ambos extremos de la resistencia con las sondas. Para medir la corriente, el voltímetro debe estar en SERIE en el circuito; tenga en cuenta que las sondas roja y negra deben orientarse correctamente con respecto al flujo de corriente.

Voltaje (Red 1): ________________V
Resistencia (Red 1): ________________Ω
Corriente (Red 1): ________________A

Ahora, con el Power Lab, mida el voltaje a través de la Red 2 (igual que la Red 1, pero en una placa de pruebas), tal como lo hizo con el voltímetro. Desconecte el voltímetro y conecte los cables de la sonda de medición de voltaje con las pinzas roja y negra. A continuación, use el cursor para hacer clic en "Channel 1" (lado derecho de la pantalla). Haga clic e ingrese a "input amplifier". Luego, en el cuadro, haga clic en el botón "differential" y establezca el rango en 5 V. Haga clic en "OK" para guardar los cambios.

Haga clic en «Inicio» (esquina inferior derecha) para recopilar datos. Se puede detener en cualquier momento para medir las desviaciones de voltaje. Para medir el voltaje recopilado, haga clic en «Detener» y use el cursor «M» (esquina inferior izquierda), moviéndolo hasta la línea base arrastrándolo sobre esta. Luego, use el cursor libre hasta la parte superior del trazo de voltaje para medir la amplitud. Lea el cambio de voltaje (ΔV) y registre los datos en papel. Puede confirmar los resultados con el voltímetro independiente.

1.4) Resistencia y conductancia en serie

Principio del divisor de voltaje: La caída de voltaje a través del total de todas las resistencias en serie es igual al voltaje de la fuente. El voltaje a través de cada resistor individual depende de la fracción de la resistencia total que representa dicho resistor. Por lo tanto:
Ecuación del divisor de voltaje; V1=V(fuente)R1/(R1+R2); fórmula de análisis de circuitos; diseño electrónico.
Un par de resistores dividirá un voltaje en la proporción de sus resistencias individuales.

Ejercicio 3

Calcule la caída de voltaje en cada resistor en la Red 3. Verifique sus cálculos midiendo el voltaje real con el voltímetro y el software del laboratorio de potencia, con la fuente de 1,5 V conectada.
Diagrama de circuito eléctrico, fuente de 1,5 V, resistores R1 510Ω, R2 1500Ω, análisis de equilibrio estático.
RED 3. Utilice los dos resistores indicados anteriormente.

Calculado:Medido:
Voltaje (a través de R1):_______VVoltaje (a través de R1): ________________V
Voltaje (a través de R2):_______VVoltaje (a través de R2): ________________V

1.5) Aplicación biológica de la muestra:

Las diferentes propiedades eléctricas del interior celular y la solución externa de una célula nerviosa activa proporcionan un ejemplo de un divisor de voltaje. Este circuito biológico puede estudiarse mediante grabaciones tomadas con electrodos externos. La región activa de la célula nerviosa, donde entran los iones, actúa como una fuente de voltaje; la corriente fluye desde esta región a lo largo del interior de la célula y regresa a través de la solución externa. Por lo tanto, entre dos puntos de la membrana que difieren en potencial existe un flujo de corriente, que necesariamente es el mismo dentro de la fibra que fuera; dado que la resistencia del interior es mayor que la del exterior, la mayor caída de voltaje ocurre aquí.

Considere el sistema y su circuito equivalente (Figura 4: A. y B.):
Diagrama de medición de corriente en célula nerviosa, que muestra conexiones al osciloscopio, y las trayectorias de resistencia Ro y Ri.
Circuito equivalente:
Diagrama de circuito con fuente de 120 mV, resistores Ro, Ri, osciloscopio; mide voltaje y flujo de corriente.
Figura 4: A (arriba). Flujo eléctrico de corriente a través de una membrana celular biológica. B (abajo). Circuito eléctrico equivalente. La fuente de voltaje (120 mV) es el voltaje transmembranal generado por el potencial de acción de la célula nerviosa.
Nota: R0 y Ri están en serie (no en paralelo) debido a la posición de la fuente de alimentación. Un dibujo equivalente del circuito es el siguiente:
Diagrama de circuito electrónico; divisor de voltaje, resistores \(R_0 = 10^4 \Omega\), \(R_t = 10^6 \Omega\).
Figura 5: Circuito eléctrico equivalente alternativo para la Figura 4A.

Ejercicio 4.
Dado que:
Vm, potencial a través de la membrana = 120 mV
Ri, resistencia del fluido interno = 106 Ω
R0, resistencia del fluido externo = 104 Ω
Calcule V0, el potencial entre los electrodos A y B.
V0: ________________V

Ejercicio 5.

Utilizando la Red 4 (véase más abajo), mida los potenciales en cada resistor (R0 y Ri).
RED 4. Conecte resistores de 4,7 K Ω y 10 K Ω en serie con la fuente de 1,5 V:
Diagrama del circuito con una batería de 1,5 V, resistores de 4,7 KΩ y 10 KΩ, que ilustra la red eléctrica.
Mida los voltajes con su voltímetro.
Voltaje (a través de R0): ________________V
Voltaje (a través de Ri): ________________V

RED 5: Igual que la Red 4, excepto que R0 = 1 K Ω
Obsérvese que en la Red 5, la resistencia externa es mucho más baja (análoga a tener mucho fluido o tejido inactivo derivando los electrodos), por lo tanto es importante registrar las señales de los nervios en aire o bajo aceite aislante, para aumentar la resistencia externa.
Voltaje (a través de R0): ________________V
Voltaje (a través de Ri): ________________V

1.6) Resistencia y conductancia en serie y en paralelo

Aplicación biológica de muestra:

Un buen ejemplo de resistencias en serie y en paralelo es la configuración eléctrica de una sinapsis que transmite de forma química. La transmisión eléctrica no es posible a través de la mayoría de las sinapsis debido al efecto de derivación del espacio sináptico. Obsérvese, sin embargo, que esta derivación probablemente sea necesaria para permitir el desarrollo de un potencial elevado a través de la membrana pre-sináptica, con la consiguiente liberación del neurotransmisor.

Diagrama de transmisión sináptica; membrana postsináptica, vía de disparo celular, resistencia eléctrica.
Figura 6: Modelo de flujo electroquímico a través de una sinapsis.
Diagrama de circuito eléctrico con resistencias (Rm1, Rm2, Rm3, Rs) para análisis de red.

Tenga en cuenta que en el tejido vivo, se forman resistencias eléctricas significativas en las membranas y en los espacios extracelulares restringidos. Los espacios fluidos relativamente grandes, como el citoplasma celular o las soluciones de baño, no representan resistencias significativas.

Ejercicio 6.
La red 6 (véase arriba y la placa de circuito) es un análogo de una sinapsis química transmisora. En las sinapsis de transmisión eléctrica, el espacio sináptico (resistencia de derivación Rs) se elimina y la corriente fluye directamente desde la célula presináptica a la postsináptica a través de Rm1 y Rm2, y luego a través de Rm3. La atenuación de la red puede medirse fácilmente con distintos valores de resistencia, ilustrando así los cambios en diferentes sinapsis. Conecte su PowerLab con 1.5V (es decir, ajuste de 0.75 voltios).

  1. Mida la diferencia de potencial (DP) a través de cada resistor en la red proporcionada, utilizando el multímetro. Anote los valores de los resistores. Haga una anotación especial de la DP a través de Rm3 (la membrana de la célula postsináptica). Voltaje: ________________V
  2. Sustituya el resistor de 330 Ω en Rs por un resistor de 330K Ω. Mida la DP en Rm3.
  3. Ahora, manteniendo Rs en 330K Ω, sustituya el resistor de 330K Ω en Rm2 por un resistor de 33K Ω. Mida la DP a través de Rm3. Voltaje: ________________V
  4. Ahora, manteniendo Rs en 330K Ω y Rm2 en 33K Ω, sustituya el resistor de 22K Ω en Rm1 por un resistor de 220 Ω. Mida la DP a través de Rm3. Voltaje: ________________V

Ejercicio 7
Un ejemplo de red resistiva serie-paralelo ocurre al considerar las propiedades del cable en la fibra nerviosa o muscular. La CONSTANTE DE LONGITUD de una fibra es la distancia a lo largo de la cual un PD a través de la membrana disminuye hasta el 37 % de su valor original. La atenuación se debe a que las resistencias interna y externa del fluido a ambos lados de la membrana son derivadas por la resistencia transversal de la membrana (relativamente alta). El valor de la resistencia limita la transmisión de una señal a lo largo del axón de una célula nerviosa. La constante de longitud es 1/e, medida según una descomposición exponencial. dE/dT = -E/RC; donde E es la diferencia de voltaje, R es la resistencia y C es la capacitancia. O en otra forma, E = Eoexp (-t/RC); donde Eo es el voltaje inicial y t es el tiempo en segundos. RC también se denomina tau (τ), la constante de tiempo.

Suponiendo que la resistencia del fluido externo es despreciable en comparación con las resistencias intracelular y de la membrana, las propiedades resistivas pasivas de la membrana pueden representarse mediante el siguiente circuito:
Diagrama de red de resistores para cálculos de la constante de longitud; muestra los valores de Rm y Ri en un circuito eléctrico.
Diagrama de red de resistores; configuración de sondas de voltaje para cálculos de la constante de longitud en el análisis de circuitos eléctricos.
Circuito en placa de pruebas con resistores y cables, que ilustra una configuración básica de circuito eléctrico.
Figura 7: Traducción de la red 7 a una configuración en placa de pruebas.

Aplique un voltaje en un extremo de la Red 7 entre A y B. Utilice un estimulador, seleccionando un pulso de duración de 1 s, amplitud de 1 V (ajustado a 0,5 V) y frecuencia de 0,75 Hz. Conecte el voltímetro a través de cada resistor de "membrana" sucesivamente y anote la diferencia de potencial (DP) a través de ese resistor. Mantenga un extremo de la sonda del voltímetro fijo en (A-conductor, rojo), mientras que el otro conductor se desplaza sucesivamente a lo largo de las posiciones 1 a 5. Represente cada valor en una gráfica de DP frente a "distancia" desde la fuente, considerando que los resistores de membrana están separados por una distancia unitaria. A partir de su gráfica, determine la constante de longitud de este circuito. Diferencia de potencial frente a distancia, gráfica; análisis de campo eléctrico, concepto de física, DP(V).
Gráfica de la constante de longitud de la Red 7:______________

El efecto de un aumento en la resistencia transversal de la membrana, como ocurriría con una vaina de mielina, o de una disminución en la resistencia longitudinal interna de la fibra asociada con un aumento del diámetro de la fibra, es un cambio en la constante de longitud. Los valores de las resistencias no corresponden a los que se encuentran realmente en un axón nervioso, sino que son aproximadamente proporcionales. Asimismo, la "distancia unitaria" en el modelo está considerablemente ampliada en comparación con una célula nerviosa real.

1.7) Capacitancia

Los condensadores almacenan carga. Si se aplica un voltaje a un condensador a través de una resistencia, fluye corriente hacia el condensador y entonces la d.d.p. (diferencia de potencial) a través del condensador aumenta exponencialmente con el tiempo hacia la d.d.p. de la fuente; el curso temporal de este cambio de voltaje depende del voltaje aplicado, la capacitancia y la resistencia en serie. Se observa un curso temporal similar pero invertido cuando un condensador se descarga.
Diagrama del circuito RC con resistencia de 100 kΩ y condensador de 10 μF.
Conecte la entrada de esta sencilla red Resistencia-Capacitancia (RC) a su estimulador, en los puntos A y B. Utilice pulsos de 1 V (ajustados a 0,5 V) con una duración de 1 s y una frecuencia de 0,75 Hz. Asimismo, debe configurar la adquisición a 20 K/s (lado derecho del panel). Conecte sus pinzas de entrada del PowerLab a través del condensador. Adquiera unos segundos de registro y luego deténgase. Utilice la ventana de zoom para ampliar el tiempo de ascenso en uno de los pulsos cuadrados. Es posible que deba repetir el acercamiento varias veces para extender la traza. Mida el tiempo de ascenso desde la línea de base hasta la parte superior de la traza de voltaje justo cuando comienza a estabilizarse. Observe el curso temporal del cambio de potencial y la distorsión de los pulsos cuadrados. Observe el efecto de reemplazar el condensador de 10 μF por uno de 0,1 μF. Al conectar el sonda de voltaje del PowerLab a través de la resistencia, puede observar el curso temporal del flujo de corriente a través del circuito. Adquiera solo unos pocos pulsos y luego deténgase para realizar la medición. Utilice el cursor "M" para moverse a la línea de base anterior al ascenso y el cursor libre hasta el punto donde el voltaje comienza a estabilizarse.

El último ejemplo incluye componentes resistivos y capacitivos. Las propiedades pasivas de cable en las fibras nerviosas y musculares están determinadas por elementos similares, derivados de las propiedades de la membrana celular. No solo existe una resistencia transversal de la membrana en la célula, sino también una capacitancia de la membrana, debida a las propiedades eléctricas de la membrana celular. El efecto de esto es influir en el curso temporal del desarrollo de los potenciales propagados electrotonicamente.

Ejemplo:
Diagrama de circuito eléctrico para cálculos de la constante de longitud; resistores, capacitores, análisis de redes.
Esta red puede construirse a partir de la Red 7 conectando los capacitores requeridos en paralelo con los resistores de membrana (Rm).

Ejercicio 8.
Conecte al circuito 7 los condensadores de 10 μF. Utilizando pulsos de 1 s, 1 V (ajuste de 0,5 V) y 0,75 Hz procedentes del estimulador, que debe conectarse en los puntos A y B, observe los cambios de potencial a través de cada resistor de membrana. Suponiendo que el voltaje umbral (el voltaje al cual se genera un potencial de acción en una célula nerviosa) sea de 0,2 V, mida el tiempo que tarda el potencial en alcanzar el umbral en cada resistor de membrana. Aquí, umbral significa el valor de potencial al que puede generarse un potencial de acción en una célula viva. Represente gráficamente los resultados como tiempo frente a 'distancia'.

Circuito electrónico en placa de pruebas para el experimento de resonancia RLC, que incluye resistores y capacitores.
Figura 8: Traducción de la red 9 a la configuración en placa de pruebas.

Gráfico de Tiempo vs Distancia; ejes: distancia (unidad de longitud), tiempo para alcanzar 0,2 V.
Gráfico para la Figura 8.

Simule el efecto de una disminución en la capacitancia de la membrana producida por un aumento en el grosor de la vaina de mielina, sustituyendo los condensadores más pequeños de 0,1 μF. Observe el cambio en el tiempo necesario para alcanzar el umbral en una resistencia seleccionada. Superponga los datos en la misma gráfica con los condensadores más grandes en su lugar.

En cuanto a una membrana muscular, se puede considerar un aumento en la capacitancia debido al incremento del área superficial de la membrana por los túbulos T asociados, lo que resulta en una capacitancia mayor en comparación con la de una neurona. Se pueden utilizar capacitores más pequeños para ilustrar la disminución de la capacitancia provocada por la adición de mielina a un axón nervioso no mielinizado. El punto principal que se debe aprender aquí es que la capacitancia eléctrica es proporcional al área superficial e inversamente proporcional al grosor de la capa dieléctrica (mielina) que separa las "placas" o superficies de almacenamiento del capacitor.

Las propiedades presentadas en un circuito modelo se observan en preparaciones vivas. Sin embargo, las células varían en sus propiedades, como la fuga a través de la membrana y la resistencia axial. Algunas células no generan potenciales de acción. No obstante, se produce un potencial de acción cuando es necesario transmitir una señal a lo largo de unos milímetros, porque las propiedades eléctricas pasivas de las células atenúan las señales en distancias de unos milímetros. En la siguiente serie de experimentos, se ilustra la grabación de potenciales de acción.

1.8) Preguntas para los estudiantes

  1. ¿Cuáles son algunos valores normales de la constante de longitud en neuronas y células musculares?
  2. ¿Qué sucedería si una membrana tuviera una baja resistencia de membrana: cambiaría la constante de tiempo (tiempo para alcanzar el 63 % del valor final)? De ser así, ¿cómo cambiaría con una resistencia de membrana más baja? ¿Cuál es la fórmula matemática generalizada para la constante de tiempo (tau)?
  3. ¿Por qué los axones más grandes, como el axón gigante del calamar, pueden conducir señales eléctricas más rápido que los axones más pequeños en el mismo preparado de calamar?

2. PROPIEDADES DE CONDUCCIÓN DE LAS CÉLULAS NERVIOSAS

2.1) Desde una placa de pruebas hasta células vivas

Las propiedades pasivas demostradas en los ejercicios con placas de circuito también son medibles en células vivas; sin embargo, estas propiedades pasivas pueden ser complicadas de aislar cuando se acompañan de potenciales de acción en células nerviosas. Las propiedades activas de la neurona son su capacidad para mantener un potencial de membrana en reposo, generar potenciales de acción y regenerarlos a lo largo de un segmento de membrana.

La propagación eléctrica a lo largo de un cordón nervioso también puede ser regenerativa dentro de neuronas individuales y de una neurona a la siguiente. En el cordón nervioso ventral (VNC) del cangrejo de río, algunas neuronas se comunican mediante uniones septadas (es decir, uniones en hendidura). Como se demostró en los ejercicios anteriores con la placa de pruebas, alterar la resistencia puede dificultar la conducción de señales eléctricas. Esto es análogo a modificar el flujo de corriente a través de las uniones en hendidura dentro del cordón nervioso ventral.

La velocidad de conducción y otras propiedades del potencial de acción compuesto en el VNC se examinan en la siguiente serie de experimentos. Demostraremos cómo obtener el VNC para experimentación y cómo provocar y medir las respuestas utilizando equipo estándar diseñado para laboratorios estudiantiles docentes.

2.2) La preparación de cangrejo de río

El cordón nervioso ventral del cangrejo de río es el más adecuado para este experimento. El nervio se puede diseccionar fácilmente, y con este preparado se pueden utilizar una variedad de protocolos que afectan la conducción. Antes de comenzar este experimento, familiarícese con los siguientes términos de anatomía del cangrejo de río:
Diagrama anatómico de crustáceo; regiones etiquetadas: cefalotórax, abdomen, apéndices.
Figura 9. Diagrama general de la anatomía del cangrejo de río.
Modificado de: http://www.enchantedlearning.com

2.3) Antecedentes sobre la conducción en un nervio

La cuerda nerviosa ventral del cangrejo de río funciona en la transmisión de señales que inician respuestas de escape, como la reacción de movimiento de la cola. En este experimento, se realizarán grabaciones a partir de toda la cuerda nerviosa intacta. Los potenciales individuales de cada neurona dentro de la cuerda nerviosa se suman para dar lugar al potencial de acción compuesto, que proporciona los pulsos eléctricos medibles mostrados por el software de grabación. Erlanger, Gasser y Bishop (1924) son algunos de los pioneros que describieron los potenciales de acción compuestos. Se muestran las características del período refractario, la velocidad de conducción y los efectos neuronales del inhibidor de las uniones en hendidura 1-heptanol o la temperatura. Aprender los principios básicos de las señales de las células nerviosas contribuye a una mejor comprensión de la función neurológica en general (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe y Grundfest, 1961).

2.4) Materiales

ArtículoCantidad
Langosta de río grande (Procambarus clarkii)1
Tijeras de disección de precisión1
Pinzas1
Cámara de nervio MLT016/X1
Portátil con software Scope1
PowerLab1
Amplificador PowerLab1
Cable de salida estimuladora para PowerLab1
Conector USB PowerLab/Computadora1
Soporte manipulador con electrodo de succión1
Pipeta de vidrio con pera1
Vaso de precipitados con solución salina para langosta de río1

2.5) Métodos

2.5.1) Disección

Asegúrese de que el recipiente para nervios, los diversos instrumentos y las soluciones estén preparados antes de diseccionar un cangrejo de río.

  1. Envuelva el cangrejo de río en una toalla de papel húmeda para sostenerlo, o simplemente sostenga el cangrejo de río con una mano, colocando las pinzas (quelípedos) entre el pulgar y el índice.
  2. Con la otra mano, haga una incisión con tijeras a través del rostrum entre las cuencas oculares.
    Proceso de disección de cangrejo de río con tijeras, estudio anatómico, educación biológica.
  3. Corte hacia abajo desde la incisión hasta que la cabeza quede completamente separada.
  4. Haga una incisión en la base del cefalotórax, por encima del abdomen; retire la cola. (Si es necesario, puede retirar los quelípedos y las patas caminadoras para facilitar este proceso.)
    Proceso de disección de insecto mostrado en un experimento de laboratorio de anatomía con configuración para examen microscópico.
  5. Retire los apéndices natatorios.
    Disección de anatomía de escorpión, enfoque en la estructura del exoesqueleto, mostrando pinzas y cuerpo segmentado.
  6. Haga un corte a lo largo de ambos lados de la superficie ventral del abdomen. Tenga cuidado de no dañar los tejidos más profundos.
    Disección de insecto; estudio de anatomía de larva; experimento de laboratorio con bisturí; investigación educativa.
  7. Levante hacia atrás la sección liberada del exoesqueleto hasta la base del abanico caudal para exponer el cordón nervioso ventral.
    Proceso de disección de invertebrado; experimento de biología; estudio anatómico; método de investigación.
  8. Utilizando el borde de la pinza, retire cuidadosamente el cordón nervioso ventral por la punta. Tenga cuidado de no estirar ni aplastar el cordón nervioso. (Cualquier nódulo observado en el cordón nervioso corresponde a ganglios del cangrejo de río.)
    Hidrodinámica en equilibrio estático, microorganismo, bajo el agua, observación científica, diagrama.
  9. Coloque el cordón nervioso sobre las barras metálicas en la cámara nerviosa. Es fundamental mantener el cordón nervioso ventral húmedo. Para lograrlo, agregue suficiente solución salina para cangrejo de río a la cámara nerviosa hasta que el nivel alcance la altura de las barras transversales metálicas. A continuación, aspire con pipeta suficiente solución salina para cangrejo de río de modo que el nivel del líquido apenas toque la parte inferior de las barras.
    Solución Salina para Cangrejo de Río (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES ajustado a pH 7.4)
  10. Una vez que el nervio esté en su lugar, conecte el cable del estimulador con los dos electrodos en forma de gancho pequeño a la cámara nerviosa. Conecte el electrodo positivo rojo a uno de los bucles metálicos externos cerca del extremo del cordón nervioso; conecte el electrodo negativo negro al bucle metálico adyacente más cercano que aún esté en contacto con el cordón nervioso.
    Excitación óptica en configuración de espectroscopía; análisis fotónico; estudio de emisión y absorción.
  11. Coloque el electrodo de succión dentro del manipulador cerca del extremo opuesto del nervio.
  12. Succionar cuidadosamente la punta del cordón nervioso ventral dentro del electrodo de grabación.

2.5.2) Grabación

Una vez que la punta de la médula espinal sea aspirada hacia el electrodo de registro, asegúrese de que el electrodo esté conectado al cabezal y de que el cabezal esté adecuadamente conectado a tierra. Esto puede lograrse simplemente conectando el cable de tierra a la jaula de Faraday. Los cables positivo y negativo del electrodo de succión también deben conectarse a los puntos correspondientes en el cabezal. El cabezal debe conectarse al amplificador diferencial, que a su vez se conecta al PowerLab.
Configuración del experimento de neurociencia con jaula de Faraday, microscopio, electrodos y sistema de amplificación.

Conecte los cables eléctricos del electrodo de succión al cabezal. Los cables deben conectarse con el rojo (positivo) en la parte superior izquierda, el verde (tierra) en el centro y el negro (negativo) en la parte inferior. Esto se indica en la Figura 10 para el cabezal que se muestra a continuación. El cable de tierra puede colocarse simplemente en el baño de solución salina. Por lo tanto, conecte un cable del electrodo de succión a la entrada + y el otro a la entrada -. No importa cuál de los cables del electrodo de succión se conecte a la entrada + o a la -.
Diagrama de símbolos de carga eléctrica; signos positivo y negativo, indicador verde.
Figura 10: Entradas para el cabezal

La configuración del amplificador es la siguiente:

CONTROLCONFIGURACIÓN
Paso altoCC
Filtro de muescaAPAGADO
Paso bajo20kHz
Compensación de capacidadSentido antihorario
Potenciómetro de ajuste fino y grueso de la compensación de CCSentido antihorario
Compensación de CC (+APAGADO)APAGADO
Potenciómetro de ganancia50
Entrada (DIF MONO TIERRA)DIF
MODO (ESTIM-PUERTA-REC)PUERTA
PRUEBA ΩAPAGADO

Conecte el cable USB suministrado a la parte trasera del PowerLab y a la toma del ordenador. Abra el software Scope en el escritorio del ordenador. En la esquina superior derecha de la pantalla, seleccione "Canal 2" y apáguelo. Ajuste la pantalla para que solo se muestre el Canal 1 deslizando la barra del centro de la pantalla hacia la parte inferior. A continuación, haga clic en el "Amplificador de entrada" para el canal 1 en la esquina superior derecha de la pantalla. Seleccione lo siguiente:

CONTROLCONFIGURACIÓN
RANGO500 mV
CAMARCADO
PASO BAJODESACTIVADO
EXTREMOS SIMPLESMARCADO
INVERTIRMARCADO

A continuación, nuevamente en "Configuración", haga clic en "Muestreo". En el cuadro titulado "Barrido" en la pantalla que aparece, seleccione lo siguiente:

CONTROLCONFIGURACIÓN
MODALIDADMÚLTIPLE
MUESTRA100 BARRIDOS
ORIGENUSUARIO
RETARDO0 SEGUNDOS

Finalmente, en la pestaña "Configuración", seleccione "Estimulador". Haga clic en la casilla para desactivar "Estimulación aislada". Elija la siguiente configuración:

CONTROLCONFIGURACIÓN
MODALIDADMÚLTIPLE
RETARDO5 ms
DURACIÓN1 ms
IMPULSO(S)2
INTERVALO15 ms
RANGO5 V
AMPLITUD0.5
  
  

Vea "Base de tiempo" en el panel derecho. Cambie "Muestra" a 1024 y "Tiempo" a 200 ms.

Gráfico de electrofisiología, potencial de acción, pico de voltaje, análisis de datos, resultado de estudio de investigación.
Figura 11: Dos potenciales de acción compuestos con un intervalo de 15 ms entre estímulos, registrados con el software Scope.

Ejercicio 1.

Seleccione el botón "Start" en la parte inferior izquierda de la pantalla. Con la configuración anterior, debería aparecer un potencial de acción compuesto claramente definido en el cuadro de recopilación de datos del osciloscopio (Figura 11). Dibuje la forma general del potencial de acción en la gráfica siguiente (Figura 12):
Gráfico de equilibrio estático, gráfica de voltaje frente a tiempo, que muestra cambios en mV a lo largo de milisegundos.
Figura 12: Gráfica en blanco para dibujar la forma del potencial de acción compuesto.

Disminuya lentamente el voltaje utilizando la pestaña en la parte superior izquierda de la pantalla. El potencial de acción debe hacerse más pequeño en magnitud hasta que su patrón de onda característico desaparezca asimismo. La reducción del voltaje disminuye el número de neuronas que se reclutan para generar el potencial de acción compuesto. Es probable que los axones más grandes sean los reclutados a voltajes más bajos y que sean los de conducción más rápida, los cuales tenderían a aparecer primero en el potencial de acción compuesto. Aumente progresivamente el voltaje para observar el efecto opuesto; a medida que se reclutan más neuronas, la onda del potencial de acción compuesto crece más. Este ejercicio ilustra el hecho de que las neuronas individuales tienen diferentes umbrales para la generación del potencial de acción. Cuando el potencial de acción compuesto no aumenta más con el incremento del voltaje de estimulación, todas las neuronas han sido reclutadas; deben ser visibles dos picos distintos en la onda del potencial de acción en la pantalla del ordenador.

Ejercicio 2.

Después de examinar el reclutamiento de neuronas y el potencial de acción compuesto resultante, observe el efecto del período refractario. Esto puede hacerse aplicando dos estímulos cercanos en el tiempo y variando el intervalo entre estímulos, luego observando en qué intervalo entre estímulos el potencial de acción compuesto, provocado por el segundo estímulo, se reduce en amplitud en comparación con el primer potencial de acción compuesto. Cambie el retraso entre pulsos utilizando la pestaña en la esquina superior izquierda de la pantalla. Siga acortando el retraso hasta que no se pueda provocar el segundo potencial de acción compuesto. El tiempo entre pulsos en el que ya no se provoca un segundo potencial de acción es el período refractario absoluto. El tiempo entre el final del período refractario absoluto y el momento en que un segundo estímulo genera un potencial de acción de amplitud completa se denomina período refractario relativo. Proporcione una estimación de los períodos refractarios absoluto y relativo en los espacios indicados.
Período Refractario Absoluto: ___________________
Período Refractario Relativo: ___________________

2.5.3) Medición de la velocidad de conducción

Con una regla milimétrica, mida la distancia entre el hilo estimulante más cercano al electrodo de registro y el electrodo de registro. A partir del trazado registrado, mida el tiempo hasta los diferentes picos de los eventos en el potencial compuesto para poder registrar la velocidad de conducción de las distintas señales eléctricas. Convierta la distancia en milímetros a metros y el tiempo en milisegundos a segundos para obtener unidades de metros por segundo.
Velocidad de conducción del 1er complejo de ondas: __________________
Velocidad de conducción del 2do complejo de ondas: __________________
Velocidad de conducción del 3er complejo de ondas: __________________
Velocidad de conducción del 4to complejo de ondas: __________________

2.5.4) Manipulación de las uniones en hendidura y/o la velocidad de conducción

A continuación, investigue las propiedades de un inhibidor neuronal. El efecto desacoplador del heptanol fue descrito por primera vez en axones septados de cangrejo (es decir, uniones en hendidura) por Johnston et al. (1980). Pronto se confirmó este efecto relacionado con la comunicación eléctrica en diversos sistemas de vertebrados e invertebrados (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Para comprender el papel de la comunicación eléctrica en este cordón nervioso ventral, se puede utilizar una solución salina con 1-heptanol (1 mM) para desacoplar las uniones en hendidura. Con una pipeta de vidrio, lave todo el cordón nervioso con una solución de heptanol. Observe el cambio registrado por el software de adquisición Scope y resúmalo. (Observe el cambio en la forma de onda y si ha variado la velocidad de conducción de las formas de onda). Alternativamente, en lugar de usar 1-heptanol, se puede sustituir la solución salina de baño por solución salina fría con hielo y monitorear cualquier cambio en la forma de onda o en la velocidad de conducción de las formas de onda.

Discusión

Nuestro objetivo en la presentación de vídeo en línea, y este documento es demostrar que las propiedades biofísicas de las células puede, en parte, ser modelado como los circuitos eléctricos. Además, con tejido vivo neural que es relativamente fácil de obtener, los principios fundamentales de la velocidad de conducción, los períodos refractarios y técnicas electrofisiológicas de registro son posibles para los laboratorios de los estudiantes de pregrado con una modesta inversión de los equipos. Los temas y paradigmas fundamentales presentados pueden modificarse fácilmente para las necesidades de los diferentes cursos.

Mantenimiento de cangrejos de río y su abundancia hace que los modelos de atractivo para los estudiantes impulsada por la experimentación. Cables de crustáceos ventral del nervio son generalmente robustos y mantener la integridad fisiológica en una solución salina mínima de horas, lo que es adecuado para un laboratorio de los estudiantes de 3 horas.

Teniendo en cuenta que algunos de los axones grandes en el VNC de los cangrejos de río están conectados a través de uniones, la experimentación adicional sobre su contribución puede llevar a cabo, y las diferentes propiedades que se encuentran en la preparación del nervio ciático de rana estándar se puede demostrar. El nervio ciático es un modelo clásico para abordar los potenciales de acción compuestos y propiedades de conducción. Incluso podría ser un experimento interesante comparativa de los estudiantes para comparar las propiedades de conducción, la contratación del axón, y los períodos refractarios entre estas dos preparaciones.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Estos experimentos se han modificado a partir de un manual de laboratorio que se ha utilizado en un curso, organizado por el Dr. HL Atwood, en el Departamento de Zoología de la Universidad de Toronto. Los ejercicios también fueron utilizados y modificados a partir de un manual que se produjo para "6 ª TALLER INTENSIVO DE IBRO neurociencia básica" y se celebró en la Universidad de Corea, Seúl, Corea del Sur en 1993 (Cooper et al., 1993). Las modificaciones actuales están obligados a utilizar equipos comunes para presentar los laboratorios de día dirigidos a los estudiantes en varias universidades. Con el apoyo de la Universidad de Kentucky, Departamento de Biología de la Oficina de Estudios de Grado y la Facultad de Artes y Ciencias.

Materiales

Tarjeta de circuitos

  1. Electronics se indican a continuación para los experimentos de placa se pueden obtener en una tienda de electrónica como Radio Shack.
  2. Junta pan, resistencias, condensadores, baterías y cables que pueden servir como cruces de la placa como se indica en los experimentos.
  3. Un voltímetro común (Wavetek Meterman voltímetro)
  4. A / D bordo para la grabación de la línea a una computadora. Las señales eléctricas se registran en la línea a una interfaz de PowerLab/4s (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EE.UU.). Utilizamos el software estándar de ADInstruments llamado Gráfico o ámbito de aplicación.

Fisiología de los experimentos

  1. Cangrejo de río (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EE.UU..
  2. Estándar cangrejos salinos: Modificado de la solución de Van Harreveld (1936). (En mM) 205 NaCl, 5,3 KCl, CaCl2 13,5 2H 2 O, 2,45 de MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES y ajustado a pH 7,4. Todos los productos químicos de solución salina se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
  3. Herramientas de disección: Bellas # 5 pinzas, tijeras finas, titular de la hoja del cuchillo, clavos # 26002-20 insectos (todos obtenidos de herramientas de Ciencias Artes (EE.UU.), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404 a 1139)
  4. Un plato de cámara del nervio (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EE.UU.) para mantener el nervio. Los cables que vienen con el plato de la cámara del nervio se puede utilizar para estimular el nervio.
  5. Un electrodo de succión se utiliza para registrar las señales.
  6. El manipulador o una pinza en un soporte de anillo también servirá como un soporte para el electrodo de succión.
  7. Jaula de Faraday
  8. Microscopio de disección
  9. Iluminador de alta intensidad (luz)
  10. Microscopio Plataforma
  11. AC / DC Amplificador diferencial (AM Model Systems Inc. 3000)
  12. PowerLab 26T (Instrumentos AD)
  13. Amplificador extracelular (Instrumentos AD)
  14. LabChart 7 (ADI Instruments)
  15. Herramientas de disección
  16. Un anillo de soporte y pinza para servir como soporte para el electrodo de succión de grabación

Referencias

  1. Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
  2. Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
  3. A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
  4. Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
  5. Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
  6. Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
  7. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
  8. Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
  9. Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
  10. Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
  11. Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
  12. Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
  13. Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
  15. Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
  16. Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
  17. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
  18. Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).

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