Ofrecemos un protocolo de paso a paso para la grabación de células enteras patch clamp de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) las corrientes en mononucleares de sangre periférica de células derivadas de los linfocitos T humanos.
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Artículo de método
De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
En los linfocitos T, la disminución de Ca2+ en el almacén intracelular de Ca2+ induce la activación de canales de Ca2+ en la membrana plasmática, denominados canales de calcio activados por la liberación de calcio (CRAC, por sus siglas en inglés). Los canales CRAC desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación de linfocitos T y la expresión génica. Se ha relacionado la función anormal de los canales CRAC en los linfocitos T con la inmunodeficiencia combinada grave y enfermedades autoinmunes 1, 2. El estudio de la función de los canales CRAC en linfocitos T humanos podría revelar nuevos mecanismos moleculares que regulan las respuestas inmunitarias normales y desentrañar las causas de enfermedades humanas relacionadas. Las grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de membrana proporcionan la evaluación más precisa de las propiedades funcionales de los canales y su regulación. La evaluación electrofisiológica de las corrientes de los canales CRAC en células T Jurkat, una línea celular de leucemia T humana, se realizó por primera vez hace más de 20 años 3; sin embargo, la medición de corrientes CRAC en linfocitos T humanos normales sigue siendo una tarea difícil. Las dificultades para registrar las corrientes de los canales CRAC en linfocitos T normales se ven agravadas por el hecho de que los linfocitos T derivados de sangre son considerablemente más pequeños que las células Jurkat, y por lo tanto, las corrientes CRAC endógenas en células completas son de muy baja amplitud. A continuación, se describe un procedimiento paso a paso que utilizamos habitualmente para registrar corrientes de Ca2+ o Na+ a través de canales CRAC en linfocitos T humanos en reposo, aislados de sangre periférica de voluntarios sanos. El método descrito aquí se adaptó de los procedimientos empleados para registrar corrientes CRAC en células T Jurkat y en linfocitos T humanos activados 4-8.
Protocolo
1. Preparación de los linfocitos T en reposo Humanos
- Utilizando RosetteSep Humanos Cocktail de enriquecimiento de células T y de densidad media RosetteSep, purificar las células T de muestras de sangre humana de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La población de células resultante debe contener un 95% CD3 + células T en reposo. Purificamos linfocitos T humanos de sangre periférica recogida de voluntarios sanos, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de la Universidad de California Davis Revisión Interna.
- Tras el aislamiento, volver a suspender las células T en reposo, con una densidad de 0,5 x 10 6 célu....
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Discusión
La investigación electrofisiológica de las corrientes de CRAC en reposo las células T humanas es una tarea difícil debido a la amplitud endógeno CRAC actual en estas células es pequeño debido al tamaño de células pequeñas (el diámetro de descanso de células T humanas está en el rango de 5.8 micras). Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para registrar de forma fiable las corrientes CRAC en el descanso los linfocitos T humanos aislados a partir de células mononucleares de sangre periférica. Esta tecnología nos pe.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Estamos agradecidos con el Departamento de Fisiología y Biología de Membrana de la Universidad de California Davis para que nos proporciona las instalaciones y un excelente ambiente para los estudios de los canales iónicos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cóctel de Enriquecimiento de Células T Humanas RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| Medio de Densidad RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| Medio RPMI 1640 con glutamina/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Suero de Ternera Fetal | Omega Scientific | FB-01 | |
| Solución GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050 | |
| Solución de vitaminas RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Solución de aminoácidos 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–etanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Trifosfato de inositol | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poli-L-Lisina Hidrobromuro | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Cloruro de lantano | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Tapsigargina | Calbiochem | 586005 | |
| Kit de elastómero de silicona Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Recubrimiento protector para semiconductores HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Mesa de laboratorio de aislamiento de vibraciones de alto rendimiento serie 63-500 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Amplificador de parche EPC 10 con cabezal | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulador | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Microscopio invertido Olympus 1X71 con objetivo de inmersión en aceite de 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Computadora con Windows | Dell | ||
| Software Pulse | HEKA Instruments | ||
| Software de gráficos y análisis científicos Origin | OriginLab | ||
| Extractor de pipetas para parche | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vidrio borosilicatado con filamento (diámetro exterior: 1,5 mm y diámetro interior: 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microfusor Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Anillos tóricos de silicona | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Láminas cubreobjetos de 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referencias
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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Reimpresiones y permisos
