El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizado para el análisis de citometría de flujo.
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Artículo de método
Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll
En este artículo
Resumen
Resumen
El aislamiento de las células inmunes que se infiltran en el sistema nervioso central (SNC) durante la infección, traumatismo, enfermedades autoinmunes o la neurodegeneración, es a menudo necesaria para definir su fenotipo y funciones efectoras. Métodos histoquímicos son fundamentales para determinar la ubicación de la infiltración de las células y para analizar el sistema nervioso central patología asociada. Sin embargo, in-situ histoquímica y técnicas de inmunofluorescencia tinción se ven limitados por el número de anticuerpos que se pueden utilizar en un momento único para caracterizar los subtipos de células inmunes en un determinado tejido. Por lo tanto, los enfoques histológicos en relación con el fenotipo inmunológico por citometría de flujo son fundamentales para caracterizar la composición de la infiltración del SNC local. Este protocolo se basa en la separación de suspensiones celulares del SNC más discontinuo gradientes de Percoll. El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizada para la identificación de las diferentes poblaciones de células inmunes en una sola muestra por citometría de flujo.
Protocolo
Preparación de los reactivos
Preparar acciones isotónica Percoll (SIP), 4 ml por el cerebro, mediante la mezcla de 9 partes de Percoll con una parte de HBSS 10 veces sin Ca + + y Mg + +.
Prepare SIP en un 70% en 1X HBSS sin Ca + + y Mg + +, 2 ml por cada cerebro se distribuye en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml.
Nota: Se recomienda que Percoll se debe utilizar a temperatura ambiente, si se utiliza en frío, las células tienden a agruparse y separación celular es menos eficaz.
Tejido de recogida y homogeneización
Anestesia....
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Discusión
Los análisis de marcadores de superficie celular en los leucocitos del SNC de los tejidos normales de ratón y se inflama se ha utilizado por décadas varios 1.3. Protocolos de aislamiento se basan en la separación de la microglía y leucocitos por cuatro densidad de centrifugación. Aquí se describe un método rápido y eficaz de aislar a los leucocitos del SNC con gradientes de Percoll discontinua. Después del aislamiento de las células, tinción con anticuerpos diferentes, tales como, pero no se limita.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) y la Universidad de Texas en San Antonio.
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Materiales
Homogeneización de tejidos y degradados
- Percoll (Amersham)
- Solución salina equilibrada de Hanks 10X, sin calcio y magnesio (Gibco)
- Medio RPMI 1640 sin rojo fenol (Gibco)
- 7 ml o 15 ml de tejido Dounce Molinos (VWR)
Citometría de flujo
- Celular tinción de amortiguación (Biolegend)
- Rata purificado anti-ratón CD16/CD32 (ratón BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemocitómetro (Fisher)
- Anti-CD45 de ratón (clon 30-F11), CD4 (clon RM4-5), CD19 (clon 6D5), BioLegend
- Fosfato de 10X de solución salina tamponada, sin calcio y magnesio (Thermo Scientific)
- Paraformaldehído (Sigma Aldrich)
- Análisis de citometría de flujo realizado con un LSR II (BD Biosciences)
Referencias
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Reimpresiones y permisos
