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Preparación de los reactivos
Preparar acciones isotónica Percoll (SIP), 4 ml por el cerebro, mediante la mezcla de 9 partes de Percoll con una parte de HBSS 10 veces sin Ca + + y Mg + +.
Prepare SIP en un 70% en 1X HBSS sin Ca + + y Mg + +, 2 ml por cada cerebro se distribuye en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml.
Nota: Se recomienda que Percoll se debe utilizar a temperatura ambiente, si se utiliza en frío, las células tienden a agruparse y separación celular es menos eficaz.
Tejido de recogida y homogeneización
Anestesiar a los ratones y perfundir a través del ventrículo izquierdo con helado de HBSS 1X. Diseccionar el cerebro y la médula espinal y mantener en RPMI sin rojo fenol hasta que todos los ratones son sacrificados.
Tejidos a cabo en 7 o 15 ml Dounce homogeneizadora que contiene 3 ml de RPMI, con cuidado hacer una suspensión de células con una mano suelta (un tamaño), seguido de un mortero de Tigh-instalación (tamaño B) a disociar aún más los tejidos. Completa el volumen de las suspensiones celulares a 7 ml con RPMI.
Gradiente de establecer
Añadir 3 ml de la SIP a la suspensión celular para hacer un último sorbo del 30%
Poco a poco la capa de la suspensión de células de 10 ml en la parte superior de la SIP el 70%. Este es el paso más crítico del procedimiento, utilice una pipeta de ayuda establecidos en el modo de evitar la mezcla de gravedad el 70% y 30% de las soluciones. Una línea plana muy claro debe ser visible en el cruce de 70% -30%.
Centrifugar 30 minutos a 500G 18 ° C. Asegúrese de centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altera.
Usando una pipeta, retire suavemente la capa de escombros de la parte superior del tubo y recoger 2,0-3,0 ml de la interfase 70% -30% en un tubo limpio cónico que contiene 8 ml de 1X HBSS. Asegúrese de que el Percoll que contiene la interfase se diluye alrededor de tres veces, mezcla un par de veces por inversión y centrifugre min 7 de 500G a 18 ° C.
Resuspender el pellet en 1 ml de tampón de tinción celular y transferirlo a un tubo de 1.5 ml y lavar una vez más utilizando una centrifugadora micro-a 10.000 G 1 min a 4 ° C.
Tinción de anticuerpos
Pellets Resuspender en 50 l de agua purificada anti-ratón CD16/CD32 diluido 1:200 en buffer de tinción celular para bloquear los sitios de unión Fc. Incubar en hielo durante 10 min. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
Añadir 50 l de mezcla de anticuerpos cócteles e incubar en hielo durante 30 minutos. Cada anticuerpo debe ser el primero titulado para evaluar la dilución óptima. Uso adecuado de las combinaciones de fluorocromos elegidos en función de las capacidades del láser y la configuración de los filtros de su citómetro de flujo particular.
Lavar las células en un tampón de tinción de células, pellets de volver a suspender en 100-200 l de buffer de tinción celular y de analizar de inmediato en el citómetro, o, alternativamente, las células pueden ser resuspendidas en el 2% de paraformaldehído (PFA), preparado en PBS y se almacenan durante la noche a 4 ° C .
Los resultados representativos:
Después de girar los gradientes, el 70% -30% de la interfase debe tener definido un halo blanco, y la cuantificación de las células se recuperó de un ratón ingenuo debe producir 5.3 x 10 5 células por ratón (cerebro, además de la médula espinal). Cerebro inflamado podría tener que van del número de células inflamatorias en función de la lesión del SNC o modelo de la enfermedad (Figura 1).
Figura 1. Aislamiento de células mononucleares, de ingenuo y EAE-cerebro en la enfermedad de pico. Las células del cerebro suspensiones fueron separadas en discontinuo 70% / 30% de los gradientes de Percoll. Manchadas las células fueron incubadas con el FC bloque seguido por anticuerpos anti-CD45 durante 30 minutos sobre el hielo. Las células fueron lavadas en buffer de tinción de células, y se fija en el 2% antes de la adquisición de PFA en un LSR-II. CD45 intensidad se mide en el eje Y, en tres poblaciones distintas se visualizan. Además de la caracterización del fenotipo inmunológico de las células CD45 de alta infiltración se implementa el uso de anticuerpos adicionales y, posteriormente, analizadas por citometría de flujo.